程婉秋王麗蘋曾芷筠江 濤 陳艷芬張祉思侯 捷唐春萍

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣東 廣州 510006；3.廣州市新藥篩選模型體系構(gòu)建與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；4.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是鼻竇與鼻腔黏膜的慢性炎癥，病程長，為耳鼻咽喉科常見慢性病之一［1]。CRS 的病理機(jī)制較復(fù)雜，研究表明CRS 中環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)受NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，NF-κB 可通過增強(qiáng)細(xì)胞因子（如IL-6、IL-8）表達(dá)，刺激抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，引起鼻黏膜慢性炎癥［2-4]。鼻竇灌注液為臨床經(jīng)驗(yàn)方［5]，具有溫陽益氣，祛濁通竅的功效。本研究通過觀察鼻竇灌注液對慢性鼻竇炎家兔模型血清中炎性因子和鼻黏膜COX-2 及NF-κB 的影響，探討鼻竇灌注液治療CRS 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 健康新西蘭大白兔56 只，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，購于廣東省花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2014-0023。

1.2 菌株 肺炎鏈球菌（臨床菌株，編號SPN-17003-W1），由廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司贈予。

1.3 藥物與試劑 鼻竇灌注液（批號17042801）購自廣州花海藥業(yè)股份有限公司；鼻淵舒口服液（批號170615）購自成都泰和健康科技集團(tuán)股份有限公司華神制藥廠。哥倫比亞培養(yǎng)基（批號20161108）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血（批號180102）購自廣州鴻泉生物科技有限公司；Trizol 試劑盒（批號9109）購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；BestarTM qPCR RT kit 試劑盒（批號2220）、BestarTM qPCR MasterMix 試劑盒（批號2043）購自美國DBI 公司；DEPC（批號6079）購自上海麥克林生化科技有限公司；IL-6 試劑盒（批號ARB13577）、IL-8試 劑盒（批號 ARB12173）、TNF-α 試劑盒（批號ARB2489）、COX-2 試劑盒（批號ARB52237）購自北京白奧萊博科技有限公司。

1.4 儀器 額戴反光鏡（丹陽市健陵醫(yī)療器械有限公司）；醫(yī)用電鉆（上海金煒五金機(jī)械有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（廣州合眾生物科技有限公司）；膨脹海綿（廣州市快康醫(yī)療器械有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；超微量紫外分析儀（美國Quawell Technology 公司）；紫外透射分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；核酸電泳儀（北京六一儀器）；臺式低溫高速離心機(jī)（珠海黑馬公司）；迷你混勻儀（廣州四億科學(xué)儀器有限公司）；旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；Stratagene Real time PCR 儀（美國Agilent 公司）；PCR 擴(kuò)增儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 菌種的制備 取肺炎鏈球菌臨床菌株（編號SPN-17003-W1），劃線法接種至哥倫比亞綿羊血平板上，置35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長狀況。培養(yǎng)兩代后得到生長旺盛的菌株，用無菌生理鹽水稀釋，比濁法調(diào)成1×108克隆形成單位（CFU）/mL 的細(xì)菌懸液備用。

2.2 造模、分組與給藥 采用賓驥［6]報道的竇口不完全堵塞+留置棉球+肺炎鏈球菌的造模方法建立慢性鼻竇炎家兔模型。除空白組外，其余動物用戊巴比妥鈉（0.03 g/kg）耳緣靜脈麻醉，沿鼻背正中線切一縱長切口，隨機(jī)選取一側(cè)上頜竇前壁，分離皮下組織及骨膜，用醫(yī)用電鉆（1 mm鉆頭）在上頜竇前壁鉆開一大約1.5 mm 小孔，取已制備3 mm×5 mm×25 mm 大小醫(yī)用膨脹海綿通過上頜竇前壁所鉆的小孔，將其置放在竇口及竇腔中，不必完全堵塞竇口，碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)面，將骨膜、皮膚逐層縫合。用1 mL 注射器抽取1 mL 細(xì)菌懸濁液，小心緩慢通過小孔注入各造模組，假手術(shù)組注入等量的生理鹽水，每周造模1 次，共3次，造模4 周后按鼻竇炎總評分標(biāo)準(zhǔn)再將模型動物隨機(jī)分為模型組、陽性組（鼻淵舒口服液4 mL/kg）及鼻竇灌注液低、中、高劑量組（1.2、2.4、4.8 g/kg），空白組、模型組、假手術(shù)組給予等量生理鹽水，經(jīng)鼻給藥，每天上、下午各1 次，每次給藥間隔約4～6 h，連續(xù)4 周。

2.3 一般情況及主要癥狀體征觀察 觀察各組新西蘭兔造模前后及治療前后的精神狀態(tài)、毛色、活動情況、進(jìn)食進(jìn)水量、體質(zhì)量變化及鼻塞、噴嚏、膿涕等主要癥狀，鼻竇炎癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)［7]見表1。

表1 鼻竇炎癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)

2.4 鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察及評分 耳緣靜脈采血后耳緣靜脈空氣針處死家兔，將鼻黏膜剝離，使用4%多聚甲醛溶液固定鼻竇黏膜標(biāo)本，48 h 后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察各組上頜竇黏膜假復(fù)層纖毛上皮排列，腺體分布排列，杯狀細(xì)胞數(shù)量，炎細(xì)胞浸潤等病理變化。

鼻黏膜炎癥按以下方法進(jìn)行評分［8]，根據(jù)光鏡下觀察計(jì)數(shù)鼻竇黏膜間質(zhì)炎性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行病理分級。（1）無明顯的炎癥，黏膜間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤（評分0 分）；（2）輕度的炎癥，黏膜間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞很少（評分1 分）；（3）中度的炎癥，黏膜間質(zhì)內(nèi)有較多的炎細(xì)胞（評分2 分）；（4）顯著/嚴(yán)重的炎癥，黏膜間質(zhì)內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤（評分3 分）。

上皮細(xì)胞損傷的分級方法按Ponikau 等的分級法。0級：纖毛完整無損傷；1 級：無明顯上皮細(xì)胞脫落，但有部分纖毛缺失；2 級：上皮細(xì)胞剝脫，但是無基底膜暴露；3 級：上皮細(xì)胞全部剝脫，基底膜暴露。

杯狀細(xì)胞增生評分按照杯狀細(xì)胞占纖毛上皮細(xì)胞比例為0 分，＜1/10；1 分，2/10；2 分，3/10；3 分，＞4/10。

2.5 IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 水平測定 末次給藥1 h，耳緣靜脈取血2 mL，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按照ELISA 試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.6 熒光定量PCR 末次給藥1 h，3% 戊巴比妥鈉麻醉（10 mL/kg），取各組家兔鼻黏膜組織50 mg，按試劑盒說明進(jìn)行。以Trizol 試劑提取RNA，利用OligoTMPrimer Analysis 軟件在新西蘭兔組織因子基因序列上設(shè)計(jì)定量引物，檢測COX-2 mRNA 和NF-κB mRNA 的表達(dá)，以β-actin做內(nèi)參。引物序列如下： COX-2 引物，正向5′CCACCTCTGCGATGCTCTTC3′，反向5′CTGGTCAAATCCTGTGCTCATAC3′；NF-κB 引物，正向5′AAGCCTTCCCGAAGTGCGT3′，反向5′ACCTCCGAAAGCGAGATAAAGA3′；β-actin 引物，正向5′ATGACCCAGATCATGTTTGA3′，反向5′TACGACCAGAGGCATACAG3′。以2 μg 總RNA 為模板，按照Bestar qPCR RT Kit 說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體系為10 μL，合成cDNA 鏈。Real time PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μL，PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃20 s，40 循環(huán)。融解曲線分析為94 ℃30 s，65 ℃30 s，94 ℃30 s，每個樣重復(fù)3 次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況及主要癥狀體征觀察 造模和給藥期間，動物的活動量、飲食和飲水量減少。造模4 周后，與假手術(shù)組比較，空白組各癥狀評分值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），模型組輕擦鼻、噴嚏、鼻腔分泌物、鼻腔炎癥和總評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見表2，提示CRS 造模成功。與模型組比較，給藥2 周后，鼻竇灌注液各劑量組和陽性組各癥狀總評分值降低（P＜0.05，P＜0.01）；給藥4 周后，鼻竇灌注液高、中劑量組和陽性組各癥狀總評分值降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 鼻竇灌注液對家兔CRS 癥狀總評分的影響（n=8）

表2 造模4 周后肺炎鏈球菌致家兔CRS 各癥狀評分（分，）

表2 造模4 周后肺炎鏈球菌致家兔CRS 各癥狀評分（分，）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 對鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)的影響 空白組鼻竇黏膜假復(fù)層纖毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，偶見少量杯狀細(xì)胞，黏膜下層無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；假手術(shù)組鼻黏膜上皮組織表現(xiàn)與空白組相似，纖毛排列整齊，偶見少量杯狀細(xì)胞，黏膜下層無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組鼻竇黏膜呈慢性炎癥表現(xiàn)，黏膜假復(fù)層纖毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺失，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，可見造模成功；陽性組鼻竇黏膜假復(fù)層纖毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊、少量缺失，炎癥細(xì)胞浸潤程度低于模型組；鼻竇灌注液低劑量組鼻竇黏膜組織表現(xiàn)與模型組相似，假復(fù)層纖毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺損、排列紊亂，纖毛缺失，杯狀細(xì)胞較多；鼻竇灌注液中劑量組假復(fù)層纖毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分缺損、排列稍整齊，杯狀細(xì)胞數(shù)目少于鼻竇灌注液低劑量組，炎癥細(xì)胞浸潤減輕；鼻竇灌注液高劑量組鼻竇黏膜組織表現(xiàn)纖毛結(jié)構(gòu)基本完整，排列整齊，偶見杯狀細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤程度低于鼻竇灌注液中劑量組。見圖2、表3。

表3 鼻竇灌注液對家兔CRS 模型鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)評分的影響（分，，n=8）

表3 鼻竇灌注液對家兔CRS 模型鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)評分的影響（分，，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖2 鼻竇灌注液對家兔CRS 模型鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)的影響（×100）

3.3 對血清IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 水平的影響 與假手術(shù)組比較，空白組IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 水平無變化（P＞0.05）；與模型組比較，鼻竇灌注液高劑量組和陽性組能夠降低血清中IL-6 水平（P＜0.05），鼻竇灌注液中、高劑量組和陽性組能夠降低血清中IL-8 水平（P ＜0.01），鼻竇灌注液各劑量組和陽性組能夠降低血清中TNF-α、COX-2 水平（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 鼻竇灌注液對家兔CRS 模型血清中炎性因子的影響（n=8）

3.4 對鼻黏膜中COX-2 和NF-κB mRNA 表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組COX-2、NF-κB mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，鼻竇灌注液各劑量組COX-2、NFκB mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 鼻竇灌注液對家兔CRS 模型鼻黏膜中基因表達(dá)的影響（n=8）

4 討論

CRS 屬于中醫(yī)學(xué)“慢性鼻淵”范疇，是以鼻流黃膿涕或濁而量多，鼻竅不通，嗅覺減退，頭痛為主癥［3]。近年來中醫(yī)藥在CRS 的治療方面通過辨證論治、內(nèi)外合治、中西醫(yī)結(jié)合以及針?biāo)幣浜系确椒ǖ木C合運(yùn)用，在改善患者證候癥狀、提高生活質(zhì)量方面取得了很大的進(jìn)步。鼻竇灌注液是由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的王德鑒教授根據(jù)多年臨床實(shí)踐自擬，該方由黃芪、淫羊藿葉、桂枝、辛夷花、白芷、野菊花、薄荷、紅花、當(dāng)歸等藥組成，具有溫祛風(fēng)、消炎解毒、調(diào)和氣血的功效［5]。本方選用溫陽活血的中藥組方并首創(chuàng)以洗鼻劑作為給藥劑型，灌注入鼻可促進(jìn)鼻竅脈絡(luò)血流通暢，達(dá)到通鼻竅，排除涕的作用。

NF-κB 是主要以p50/p65 異源性二聚體形式普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的核轉(zhuǎn)錄因子，具有多項(xiàng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。在正常的生理情況下，NF-κB 與其抑制蛋白（inhibitors of kappaB protein，IκB）結(jié)合，形成異源三聚體（p50-p65-IκB），以無活性非DNA 結(jié)合形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，NF-κB 抑制蛋白IκB 的上游激酶即IκB 激酶（IκB kinase，IKK）活化，使IκB 磷酸化而失活，活化的NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)異位至細(xì)胞核內(nèi)，與特定的κB 序列結(jié)合從而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，如引起炎癥介質(zhì)表達(dá)和釋放［9]。炎癥介質(zhì)可以反作用激活NF-κB，從而引起正反饋?zhàn)饔?，使得炎癥反應(yīng)加重［10]。受NF-κB 調(diào)控的基因表達(dá)產(chǎn)物囊括了大多數(shù)參與炎癥形成的主要細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如TNFα，白細(xì)胞介素、黏附分子等，且NF-κB 活化還可調(diào)控COX-2 的表達(dá)［11-12]。

COX-2 是一種誘導(dǎo)型酶，正常生理情況下呈不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)，在組織損傷或炎癥情況下可在一系列胞內(nèi)和胞外促炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等刺激下迅速表達(dá)，導(dǎo)致大量的花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，引起慢性炎癥［3]。炎癥反應(yīng)中，COX-2 是NF-κB 的靶基因，且NF-κB 是COX-2 上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一［13]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-8 及TNF-α 同時參與了CRS 黏膜炎癥發(fā)生和發(fā)展，是CRS 中非常重要的三個炎癥細(xì)胞因子［14]。Wang 等［15]研究發(fā)現(xiàn)，CRS 患者的鼻黏膜被大量炎癥細(xì)胞浸潤，IL-6、IL-8、TNF-α 等多種炎性細(xì)胞因子以及氧自由基生成增多，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，引發(fā)大量炎癥介質(zhì)釋放。TNF-α 可上調(diào)IL-8 的表達(dá)，能促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、吸引中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集，進(jìn)而引發(fā)炎癥介質(zhì)之間的級聯(lián)反應(yīng)［16]。李巖等［17]應(yīng)用RTPCR 發(fā)現(xiàn)CRS 模型家兔鼻黏膜中IL-8 mRNA 和TNF-α mRNA 表達(dá)增高，顯示IL-8 和TNF-α 參與了CRS 的發(fā)病過程。IL-6 是重要的促炎因子，可與TNF-α 等發(fā)揮協(xié)同作用，促使炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成，引起細(xì)胞損害。Kim 等［18]研究發(fā)現(xiàn)CRS 患者鼻黏膜中IL-6 的表達(dá)與正常人相比顯著性升高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻竇灌注液各劑量組和陽性組降低了家兔主要癥狀評分值及總評分值，并改善了鼻黏膜組織的形態(tài)學(xué)變化，也降低了血清中IL-6、IL-8、TNF-α 和COX-2 的水平以及鼻黏膜中COX-2 mRNA 和NF-κB mRNA的表達(dá)，表明COX-2、NF-κB、IL-6、IL-8 以及TNF-α 參與了CRS 的炎癥反應(yīng)過程，且鼻竇灌注液可能通過阻斷NFκB 信號通路來減少COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α 的表達(dá)，限制炎癥反應(yīng)，減輕鼻黏膜炎癥，達(dá)到治療CRS 的目的。鼻竇灌注液對CRS 有治療作用，其機(jī)制可能是通過NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控COX-2 的表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子生成從而發(fā)揮抗炎作用。