韓曉瑜，李嘉斌，丁杰英，溫慶偉

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

糖尿病是人體代謝紊亂所造成的基礎(chǔ)疾病且無(wú)法根治而伴隨終身，因此長(zhǎng)期高血糖會(huì)導(dǎo)致多種的并發(fā)癥所發(fā)生［1]。糖尿病腎病是因?yàn)槟I臟的高糖環(huán)境使大量的活性氧（ROS）產(chǎn)生而造成腎臟微血管氧化應(yīng)激損傷的常見(jiàn)糖尿病并發(fā)癥，其多出現(xiàn)于糖尿病后期病程上。對(duì)糖尿病腎病的治療主要以藥物調(diào)控血糖，同時(shí)聯(lián)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和鈣拮抗劑藥物進(jìn)行治療［2-3]。但從治療效果看，存在著個(gè)體差異大、治療效果不佳等情況，所積極探索防治糖尿病腎病的藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

姜黃素是從傳統(tǒng)中藥材姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longa L.）的根莖中提取的一種多酚類(lèi)物質(zhì)，具有良好的降血糖、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性，但是其對(duì)糖尿病腎病的機(jī)制尚不完全清楚［4-5]。本研究采用多次注射低劑量鏈脲佐菌素及摘除右腎法誘導(dǎo)建立糖尿病腎病小鼠模型，探討姜黃素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟自噬及氧化應(yīng)激的影響，為其在糖尿病腎病的防治中提供科學(xué)的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（桂）2017-0005。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥品與試劑 纈沙坦片，海南皇隆制藥股份有限公司（批號(hào)190114）；姜黃素，瑞士Adamas 公司（純度98%，批號(hào)190124B）；鏈脲佐菌素，美國(guó)Sigma 公司（批號(hào)S075）；線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、III 試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)S075）；羥自由基（-OH）、活性氧（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號(hào)20190817、20190825）；錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）ELISA 試劑盒，晶美生物工程有限公司（批號(hào)20190907、20190912、20190909）；尿蛋白（UP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）試劑盒，上海榮盛生物技術(shù)有限公司（批號(hào) 20190814、20190811、20190820）；Beclin1、LC 3、磷酸 化-mTOR（p-mTOR）一抗，英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)191017、191011、190927）。

1.3 儀器 血糖儀，瑞士羅氏公司ACCU-CHEK Performa；7060C 型全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；9602A 酶標(biāo)儀，北京艾普生設(shè)備有限公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 糖尿病腎病小鼠模型建立和給藥 參考文獻(xiàn)［6]，50 只空腹昆明小鼠行右腎摘除手術(shù)，另取10 只昆明小鼠為空白組行不摘除右腎的假手術(shù)。手術(shù)結(jié)束1 周后，向行摘除右腎的小鼠尾靜脈注射40 mg/kg 鏈脲佐菌素（STZ），每天1 次，連續(xù)3 d。末次注射3 d 后，檢測(cè)小鼠空腹血糖（FBG），將FBG ≥11.1 mmol/L 的小鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組20 mg/kg、姜黃素高劑量組400 mg/kg、姜黃素低劑量組200 mg/kg，每組10 只，各組小鼠連續(xù)灌胃90 d，每日1 次；空白和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水。

2.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)分 根據(jù)文獻(xiàn)［7]，隨機(jī)取互不重疊的10 個(gè)視野，對(duì)腎小球系膜基質(zhì)增生、空泡樣變性、組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)3 項(xiàng)進(jìn)行病變程度的半定量評(píng)分。計(jì)分為正常，0 分；輕度損害（病變范圍＜30%），1 分；中度損害（病變范圍30%～60%），2 分；重度損害（病變范圍＞60%），3 分。

2.3 觀察指標(biāo) 末次給藥后，收集小鼠尿液計(jì)算尿量，并檢測(cè)24 h 尿蛋白（UP）含有量。血糖儀檢查小鼠FBG，測(cè)定血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。HE 染色法觀察糖尿病腎病小鼠腎臟的病理學(xué)變化。試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)腎臟的羥自由基（-OH）、活性氧（ROS）水平及線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、III（Complex I、III）的活性。ELISA 法檢測(cè)腎臟錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。Western blot 檢測(cè)腎臟組織中線粒體自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC 3 的蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對(duì)DN 小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN水平的影響 與空白組相比，模型組小鼠24 h 尿量增加，UP 及血清Scr、BUN 水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦組、姜黃素高、低劑量組小鼠的24 h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 水平減少（P＜0.05）；姜黃素高劑量組小鼠24 小時(shí)的尿量、UP 及血清Scr、BUN 含量低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN 水平（，n=10）

表1 各組小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN 水平（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 糖尿病腎病小鼠腎臟組織病理學(xué) 空白組小鼠腎小球飽滿無(wú)空泡，無(wú)細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況；模型組小鼠腎組織中存在大量的空泡，腎小球系膜基質(zhì)增生，包曼氏囊腔皺縮且較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；纈沙坦組組織空泡少見(jiàn)，包曼氏囊腔輪廓有所恢復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少（P＜0.01）；姜黃素高劑量組腎小球結(jié)構(gòu)較完整飽滿，包曼氏囊腔有少量空泡，包曼氏囊腔輪廓皺縮程度減少，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（P＜0.01）；姜黃素低劑量組曼氏囊腔空泡及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，但較模型組少（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)分（，n=10）

表2 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)分（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖1 各組小鼠腎臟病理變化（HE，×400）

3.3 姜黃素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟中-OH、ROS 水平及Mn-SOD、CAT 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎臟中-OH、ROS 水平增加，Mn-SOD、CAT 的活性下降（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦、姜黃素高、低劑量組小鼠的腎臟-OH、ROS 水平降低，Mn-SOD、CAT 水平增加（P＜0.05）；姜黃素高劑量組小鼠腎臟-OH、ROS 水平較姜黃素低劑量組低，Mn-SOD、CAT 的活性較姜黃素低劑量組高（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中-OH、ROS、Mn-SOD、CAT 水平（，n=10）

表3 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中-OH、ROS、Mn-SOD、CAT 水平（，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 姜黃素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟中Complex I、III 活性的影響 與空白組相比，模型組小鼠腎臟Complex I、III 活性降低（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦、姜黃素高、低劑量組小鼠腎臟中Complex I、III 活性提高（P＜0.01）；姜黃素高劑量組小鼠腎臟Complex I、III 活性較姜黃素低劑量組高。見(jiàn)表4。

表4 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中Complex I、III 活性（，n=10）

表4 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中Complex I、III 活性（，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

3.5 姜黃素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 的蛋白表達(dá)影響 與空白組比較，模型組小鼠腎臟中p-mTOR 蛋白表達(dá)增加，Beclin1表達(dá)及LC3 II/LC3 I 比值減少（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦、姜黃素高、低劑量組小鼠的腎臟中p-mTOR 蛋白減少，Beclin1 蛋白表達(dá)及LC 3 II/LC 3 I 比值增加（P＜0.01）。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表達(dá)

表5 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白p-mTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表達(dá)（，n=10）

表5 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白p-mTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表達(dá)（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

自噬為真核細(xì)胞的一種高度保守的進(jìn)化過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)的自身修復(fù)、物質(zhì)再利用、抵抗氧化應(yīng)激和慢性炎癥反應(yīng)等損傷的主要途徑，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)定起重要的作用［8]。自噬小體會(huì)包裹受損或老化的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)及大分子物質(zhì)，通過(guò)溶酶體降解的方式，消除細(xì)胞毒性蛋白的聚集，使細(xì)胞內(nèi)線粒體所產(chǎn)生的能力能被正常細(xì)胞所利用，維持細(xì)胞存活，而自噬異常則導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙［9]。在腎組織中，自噬是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要保護(hù)機(jī)制，正常情況下在腎臟的近端小管、足細(xì)胞都表現(xiàn)出高活躍度的自噬［10]。高糖的內(nèi)環(huán)境下，會(huì)促進(jìn)足細(xì)胞的自噬流，加速毛細(xì)血管擴(kuò)張及腎小球硬化，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

腎臟內(nèi)的高血糖內(nèi)環(huán)境激活DAGPKC-NADPH 氧化酶信號(hào)通路，上調(diào)ROS 的生成，大量ROS 的堆積及機(jī)體抗氧化酶水平相對(duì)不足，使體內(nèi)氧化/抗氧化作用失衡，進(jìn)一步損傷線粒體呼吸鏈酶中Complex I、III 活性和線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)，致線粒體功能障礙引起細(xì)胞凋亡［11]。提高機(jī)體的抗氧化酶Mn-SOD、CAT 的活性，增加對(duì)ROS、-OH 的清除能了，減少體內(nèi)的氧化應(yīng)激的損傷，使線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性提高，恢復(fù)線粒體功能，對(duì)治療糖尿病腎病有著重要的治療意義。但單純的提高機(jī)體的抗氧化酶的活性并不能很好的恢復(fù)腎臟細(xì)胞及線粒體的功能，因?yàn)楸谎趸瘧?yīng)激損傷的線粒體、凋亡的細(xì)胞需要通過(guò)機(jī)體內(nèi)的自噬降解，以提高線粒體及細(xì)胞的質(zhì)量，增強(qiáng)細(xì)胞活力。因此在提高機(jī)體抗氧化能力的同時(shí)，還需增加機(jī)體對(duì)受損及壞死組織的自噬清除能力，才能更好的使線粒體所產(chǎn)生的能力能被正常細(xì)胞所利用，增強(qiáng)細(xì)胞的活力。

mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為自噬信號(hào)通路中一個(gè)十分關(guān)鍵的中心抑制劑［12]。mTOR 是缺乏氨基酸、生長(zhǎng)因子、氧或ATP 等細(xì)胞應(yīng)激源的自噬反應(yīng)的匯集點(diǎn)，其通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)的反饋機(jī)制，激活溶酶體重組多種因素誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［13-14]。自噬效應(yīng)蛋白Beclin1 和微管相關(guān)輕鏈蛋白LC 3 均是重要的自噬標(biāo)記蛋白。自噬早期的囊泡由自噬效應(yīng)蛋白Beclin1 與Ⅲ級(jí)PI3K 所結(jié)合形成的復(fù)合物［15]。正常情況下，LC 3 蛋白以LC 3 I 存在于細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)自噬啟動(dòng)時(shí)，LC 3 I 會(huì)被Atg 4 酶切轉(zhuǎn)變成LC 3 II 的自噬體膜型，并與自噬體膜相結(jié)合［16]。故機(jī)體內(nèi)LC 3 II 與LC 3 I 的比值及Beclin1 蛋白的表達(dá)水平會(huì)作為衡量自噬水平高低的評(píng)判指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，姜黃素能改善糖尿病腎病下小鼠尿量、Scr、BUN、UP 的腎功能指標(biāo)及其病理狀態(tài)，同時(shí)能提高腎臟中CAT、Mn-SOD、Complex I、III 的活性及降低-OH、ROS 的含量。減少p-mTOR 蛋白表達(dá)，增加Beclin1蛋白表達(dá)及LC 3 II/LC 3 I 比值。提示，姜黃素對(duì)糖尿病腎病小鼠的作用機(jī)制為提高機(jī)體抗氧化能力的同時(shí)增加機(jī)體自噬活性，以達(dá)到對(duì)腎臟的治療保護(hù)作用。