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        ABO等位基因調(diào)控區(qū)突變致抗原弱表達(dá)原因分析

        2021-06-26 03:19:28顧玉微王成云潘秋輝陳廣潔
        檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:增強(qiáng)子微衛(wèi)星外顯子

        顧玉微,王成云,顧 萍,潘秋輝,王 靜,陳廣潔

        (1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心輸血科,上海 200127;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,上海 200025)

        ABO血型系統(tǒng)在輸血醫(yī)學(xué)、移植學(xué)和法醫(yī)學(xué)中有著極其重要的作用,是目前最具臨床意義的血型系統(tǒng)[1]。人類(lèi)ABO血型基因位于9q34.1-34.2,含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子,編碼區(qū)長(zhǎng)1 062 bp,基因上游5'非編碼區(qū)存在1個(gè)總長(zhǎng)度為18~20 kb的調(diào)控區(qū)[2-3]。ABO基因外顯子和內(nèi)含子的突變、插入或缺失,以及受不同mRNA轉(zhuǎn)錄剪接模式的影響,調(diào)控區(qū)出現(xiàn)等位基因重組、片段缺失、甲基化/去甲基化或CpG島形成等,均可導(dǎo)致ABO抗原表達(dá)的弱化。本研究對(duì)1例ABO血清學(xué)鑒定困難的患兒進(jìn)行基因序列測(cè)定和序列分析,查找抗原弱表達(dá)的原因。

        1 材料和方法

        1.1 研究對(duì)象

        選取上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科收治的二尖瓣返流患兒1例,女,12歲,術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)血型鑒定正反定型不符。

        1.2 儀器和試劑

        WADiana/8XT全自動(dòng)血型系統(tǒng)(西班牙Diagnostic Grifols S.A公司)及配套ABO-Rh血型確認(rèn)卡(DG Gel Confirm卡)、中性卡(DG Gel Neutral卡)、抗球蛋白卡(DG Gel Coombs卡)。ABO反定型細(xì)胞、抗H抗體、篩選細(xì)胞均購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司。DNA純化試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司],聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增試劑(日本Takara公司),C1000 Touch Thermal Cycle PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 樣本采集 采集本例患兒的靜脈血,乙二胺四乙酸二鉀抗凝,抽提DNA,置于-20 ℃保存。

        1.3.2 血清學(xué)試驗(yàn) 采用微柱凝膠法進(jìn)行ABO血型鑒定、直接和間接抗球蛋白試驗(yàn)、抗體篩查試驗(yàn)。

        1.3.3 基因分型試驗(yàn) 抽提患兒全血樣本中的基因組DNA,采用PCR擴(kuò)增ABO基因增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、第1~7號(hào)外顯子及其相鄰的內(nèi)含子區(qū)域序列。參照美國(guó)國(guó)立生物信息中心(the National Center for Biotechnology Information,NCBI)GenBank(https://www. ncbi. nlm. nih.gov / gene /? term=ABO)中ABO基因序列設(shè)計(jì)引物,見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系為T(mén)aq DNA聚合酶(5 U/μL)12.5 μL、引物(10 mmol/μL)各1 μL、待測(cè)DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL,總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、64 ℃退火30 s、72℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物由上海華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與血型基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),以標(biāo)準(zhǔn)序列(A101)判斷患兒的血型基因型。

        表1 ABO血型基因分型擴(kuò)增及測(cè)序引物序列

        2 結(jié)果

        2.1 血清學(xué)結(jié)果

        ABO血型鑒定和抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果顯示:患兒血型表型為Aweak型,其父為A型,其母為B型。見(jiàn)表2。

        表2 血清學(xué)血型鑒定和抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果

        2.2 ABO血型基因分型結(jié)果

        擴(kuò)增患兒及其父母ABO基因第1~7號(hào)外顯子、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū),將測(cè)序結(jié)果與A101等位基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì),對(duì)照ABO血型基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)患兒3號(hào)外顯子存在106G>T變異,4號(hào)外顯子存在188G>A、189C>T變異,6號(hào)外顯子存在261delG缺失和297A>G變異,其余外顯子未見(jiàn)異常,A等位基因增強(qiáng)子CBF/NF-Y微衛(wèi)星區(qū)存在4個(gè)43 bp串聯(lián)?;純焊赣H6號(hào)外顯子存在261delG缺失,7號(hào)外顯子存在467C>T變異,其余外顯子、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)未見(jiàn)異常,通過(guò)與血型基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),確定其基因型為A102/O01。患兒母親3號(hào)外顯子存在106G>T變異,4號(hào)外顯子存在188G>A、189C>T變異,5號(hào)外顯子存在220C>T變異,6號(hào)外顯子存在261delG缺失和297A>G變異,7號(hào)外顯子存在526C>G、646T>A、657C>T681G>A、703G>A、771C>T、796C>A、803G>C、829G>A、930G>A和1096G>A變異,其余外顯子、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)未見(jiàn)異常,通過(guò)與血型基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),確定其基因型為B101/O02。見(jiàn)表3、圖1和圖2。

        表3 血型基因分型結(jié)果

        圖1 本例患兒第1~7號(hào)外顯子基因測(cè)序結(jié)果

        圖2 患兒增強(qiáng)子區(qū)測(cè)序結(jié)果

        3 討論

        人類(lèi)紅細(xì)胞ABO血型是目前最具臨床意義的血型系統(tǒng),血型血清學(xué)技術(shù)雖然相對(duì)較完善和標(biāo)準(zhǔn)化,但只能鑒定表型,在鑒定某些異常表達(dá)的個(gè)體和分析遺傳學(xué)規(guī)律時(shí)受到限制,疑難標(biāo)本不易準(zhǔn)確鑒定血型。當(dāng)正反定型不能產(chǎn)生ABO抗原與抗體的互補(bǔ)結(jié)果時(shí),排除技術(shù)上可能發(fā)生的錯(cuò)誤后,還需要考慮細(xì)胞抗原表位的變異情況,可采用基因分型技術(shù)對(duì)這些ABO疑難血型標(biāo)本進(jìn)行基因測(cè)序,明確血型基因型,分析抗原變異的原因。

        有研究結(jié)果表明,ABO血型基因型和表型直接相關(guān)[4-6],大多數(shù)遺傳變異表現(xiàn)為1個(gè)或多個(gè)單核苷酸突變,這些變化在基因水平上可以分布在ABO基因的整個(gè)編碼區(qū),其中E6、E7尤為多見(jiàn),導(dǎo)致編碼的氨基酸改變,從而使A抗原或B抗原的表達(dá)減弱,甚至完全不表達(dá)。然而,有一部分抗原變異的患者在ABO基因外顯子區(qū)域并未找到可能的變異位點(diǎn),進(jìn)一步對(duì)ABO基因調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子、啟動(dòng)子及其相鄰的內(nèi)含子區(qū)域序列的研究發(fā)現(xiàn),調(diào)控區(qū)序列對(duì)ABO血型抗原的表達(dá)亦存在影響[7-8]。

        ABO基因的轉(zhuǎn)錄受調(diào)控區(qū)影響,其中包括引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄開(kāi)始信息的啟動(dòng)子區(qū)域及位于ABO基因上游約3.8 kb的增強(qiáng)子區(qū)域[7]。這段增強(qiáng)子區(qū)域包含了1個(gè)由43 bp的重復(fù)片段組成的微衛(wèi)星序列,這個(gè)片段與調(diào)控ABO的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)[8]。常見(jiàn)的ABO等位基因有著不同數(shù)量的43 bp重復(fù)片段,呈現(xiàn)多態(tài)性。A1基因只有1個(gè)43 bp的重復(fù)序列,即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCATT-3',這個(gè)重復(fù)序列的第nt41位為A;B基因和部分O01等位基因在此區(qū)域?yàn)?個(gè)43 bp長(zhǎng)度的重復(fù)序列,各序列第nt41位均為G,即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCGTT-3';大部分的O01和O02等位基因在此區(qū)域也為4個(gè)43 bp長(zhǎng)度的重復(fù)序列,但不同的是,其第1個(gè)重復(fù)序列的第nt41位為C,即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCCTT-3';另外3個(gè)重復(fù)序列的第nt41位均為G,即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCGTT-3'[9]。

        本例患兒血清學(xué)血型鑒定結(jié)果為Aweak,外顯子編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn),而位于調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子區(qū)域存在異常變化。家系調(diào)查結(jié)果顯示,患兒父親基因型為A102/O01,母親基因型為B101/O02,分析發(fā)現(xiàn)本例患兒父親的A102和O01基因在第7號(hào)外顯子處發(fā)生了交換,使患兒A等位基因和O等位基因都發(fā)生了變化,從而產(chǎn)生了新的序列。同時(shí)基因重組還導(dǎo)致了調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子微衛(wèi)星區(qū)域發(fā)生改變。本例患兒外顯子編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)各亞型的特異變異位點(diǎn),也未發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn),因此其抗原變異并不是由ABO編碼區(qū)外顯子變異導(dǎo)致的,而是由調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子微衛(wèi)星區(qū)域發(fā)生改變導(dǎo)致的。

        ABO基因增強(qiáng)子測(cè)序結(jié)果顯示,本例患兒A等位基因增強(qiáng)子CBF/NF-Y微衛(wèi)星區(qū)為4個(gè)43 bp的重復(fù)串聯(lián)序列,其第1個(gè)串聯(lián)序列的第nt41位為C,另外3個(gè)串聯(lián)序列的第nt41位均為G。而正常A等位基因增強(qiáng)子CBF/NF-Y微衛(wèi)星區(qū)只有1個(gè)43 bp的串聯(lián),其第nt41位為A。有研究認(rèn)為,ABO基因的轉(zhuǎn)錄受CCAAT結(jié)合因子CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列的影響[10-11]。不同串聯(lián)拷貝數(shù)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn),A抗原的正常表達(dá)有賴(lài)于完整的1個(gè)43 bp串聯(lián)CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列,而B(niǎo)抗原的正常表達(dá)有賴(lài)于完整的4個(gè)43 bp串聯(lián)CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列[12]。本例患兒正是由于基因重組導(dǎo)致A等位基因增強(qiáng)子特征消失,出現(xiàn)類(lèi)似O等位基因的特征,從而表現(xiàn)為A抗原弱化。THURESSON等[13]也報(bào)道過(guò)與本例患兒相似的病例,是由基因重組導(dǎo)致的增強(qiáng)子改變。另外,還有各種增強(qiáng)子微衛(wèi)星序列不同串聯(lián)拷貝數(shù)引起血型弱表達(dá)的報(bào)道[8,14]。目前,對(duì)于微衛(wèi)星序列串聯(lián)拷貝數(shù)與基因轉(zhuǎn)錄活性的研究不多,但可以肯定的是,CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列與ABO抗原表達(dá)間確實(shí)有相關(guān)性,但其真正的作用機(jī)制目前尚不明確。由此可見(jiàn),本例患兒的A抗原弱表達(dá)現(xiàn)象很有可能是由于其增強(qiáng)子區(qū)CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列發(fā)生重組引起串聯(lián)拷貝數(shù)異常所致。

        ABO抗原弱表達(dá)是目前輸血研究的熱點(diǎn),調(diào)控區(qū)變異引起抗原弱化的現(xiàn)象已逐漸被人們所認(rèn)識(shí),本研究可為今后抗原弱化機(jī)制的研究提供一定幫助。

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