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        MALDI-TOF MS在人工關節(jié)置換術后病原菌快速鑒定中的價值

        2021-06-26 03:19:32丁毅偉韓志海
        檢驗醫(yī)學 2021年6期
        關鍵詞:瓊脂革蘭葡萄球菌

        丁毅偉,韓志海

        (解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心呼吸與危重癥醫(yī)學科,北京 100084)

        隨著醫(yī)學技術的進步,越來越多的患者選擇人工關節(jié)置換,感染是手術后最嚴重的并發(fā)癥之一[1],及時進行抗感染治療是改善患者預后的關鍵,快速、準確的病原菌鑒定意義重大。但是,關節(jié)液樣本的培養(yǎng)需要2~3 d,少數(shù)苛養(yǎng)菌和真菌的培養(yǎng)時間更長,甚至需要14 d;將關節(jié)液放入血培養(yǎng)瓶中進行增菌培養(yǎng)也需要至少8~12 h。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術可快速鑒定報陽血培養(yǎng)樣本中的病原菌,較傳代培養(yǎng)之后對瓊脂上的單個菌落進行常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定,鑒定時間可從平均24.48 h減少到1 h內(nèi)[2-3]。常規(guī)MALDI-TOF MS最耗時的過程是在鑒定之前對樣本進行傳代培養(yǎng)。HB&L微生物培養(yǎng)系統(tǒng)(簡稱HB&L系統(tǒng),意大利Alifax公司)最初被用于快速篩查尿液樣本中的病原菌,能夠快速增菌培養(yǎng),采用獨特的光散射技術實時監(jiān)測麥氏濃度,提示細菌生長。有研究結果表明,HB&L系統(tǒng)可以用于報陽血培養(yǎng)樣本的快速培養(yǎng),聯(lián)合MALDI-TOF MS,鑒定準確率和時效性均較高,已被應用于血流感染的快速診斷[4]。但將關節(jié)液樣本置于血培養(yǎng)瓶中,陽性報警后,經(jīng)HB&L系統(tǒng)前處理后直接采用MALDI-TOF MS鑒定病原菌的研究尚不多見。本研究采用MALDI-TOF MS對經(jīng)HB&L系統(tǒng)前處理后的關節(jié)液樣本進行直接鑒定,并與常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定、平板培養(yǎng)鑒定結果進行比較,評價直接MALDI-TOF MS與HB&L系統(tǒng)聯(lián)用在快速鑒定血培養(yǎng)瓶報陽關節(jié)液樣本病原菌中的價值。

        1 材料和方法

        1.1 樣本來源

        采用無菌方法采集解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心人工關節(jié)置換術后疑似感染患者的關節(jié)液樣本104例,分別注入需氧血培養(yǎng)瓶和厭氧血培養(yǎng)瓶各10 mL,另外3 mL關節(jié)液及時送至檢驗科行常規(guī)培養(yǎng)。104例關節(jié)液樣本中,99例為單一細菌感染,5例為混合菌感染。

        1.2 儀器與試劑

        MALDI-TOF MS儀及配套α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液(德國Bruker公司);甲酸、無水乙醇、乙腈(美國Sigma-Aldrich公司);2 mL血培養(yǎng)瓶(意大利Alifax公司);BacT/A lert 3D自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)和需氧、厭氧血培養(yǎng)瓶(美國貝克曼庫爾特公司);需氧血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板(鄭州安圖公司);Insepack ST740CG血清分離膠促凝管(廣州陽普公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定 將已注入關節(jié)液的需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶置于BacT/A lert 3D自動血液培養(yǎng)系統(tǒng),將陽性報警關節(jié)液分別接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板進行傳代培養(yǎng),5% CO2環(huán)境下35 ℃孵育18~24 h,挑取單個菌落均勻涂布于靶板上,自然干燥后加入1 μL甲酸,干燥后加基質(zhì)液1 μL,采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

        1.3.2 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定 用無菌注射器將需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶中的陽性菌液抽出2 mL,吸取10 μL轉種于HB&L血培養(yǎng)瓶中繼代培養(yǎng)1~3 h,當達到1.5麥氏濃度后,從培養(yǎng)液中取1 mL陽性菌液置于1.5 mL的Eppondorf管中,11 346×g離心2 min,重復操作2次,取1 μL沉淀均勻涂布于MALDI-TOF MS儀靶板,自然干燥后加1 μL甲酸,干燥后加基質(zhì)液1 μL,采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

        1.3.3 分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定 從報陽血培養(yǎng)瓶中抽取3 mL菌液至Insepack ST740CG血清分離膠促凝管,600×g離心10 min,棄上清液,用無菌棉簽挑取富集在分離膠表面的細菌沉淀物,加入1 000 μL去離子水,混勻后11 346×g離心2 min,重復操作2次,棄上清,加入500 μL無水乙醇混勻,11 346×g離心2 min,棄上清,室溫環(huán)境開蓋放置2 min,取1 μL沉淀均勻涂布于MALDI-TOF MS儀靶板,晾干后加1 μL甲酸,干燥后加基質(zhì)液1 μL,采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

        1.3.4 平板培養(yǎng) 將無菌注射器收集的3 mL關節(jié)液充分混合后,分別滴加于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板,5% CO2環(huán)境35 ℃孵育18~24 h,挑取單個菌落均勻涂布于MALDI-TOFMS儀靶板,自然干燥后加1 μL甲酸,干燥后加基質(zhì)液1 μL,采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

        1.4 判斷標準

        根據(jù)MALDI-TOF MS儀說明書要求:>2.000分,可鑒定到種水平;1.700~1.999分,可鑒定到屬水平;≤1.700分為結果不可靠;如≤1.700分,但鑒定結果前3位均屬于同一種菌,也認為結果正確,否則為結果不可靠。

        2 結果

        2.1 4種方法鑒定結果比較

        99例單一細菌感染樣本中,采用HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定和常規(guī)MALDITOF MS鑒定均有15例陰性,常規(guī)培養(yǎng)有39例陰性。血培養(yǎng)瓶增菌培養(yǎng)陽性樣本中,2種直接MALDI-TOF MS鑒定和常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定檢出率均為84.8%(84/99),平板培養(yǎng)檢出率僅為60.6%(60/99)。

        HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的檢出率分別為86.9%(40/46)、91.9%(34/37)。分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的檢出率分別為78.3%(36/46)、83.8%(31/37)。2種直接MALDI-TOF MS鑒定方法檢出的革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為主,革蘭陰性菌以大腸埃希菌為主,有84株病原菌被鑒定至種水平,僅1株白念珠菌被鑒定至屬水平。HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定分別有9例和16例樣本培養(yǎng)出細菌,但鑒定失?。怀R?guī)MALDI-TOF MS鑒定均鑒定出細菌。平板培養(yǎng)檢出率低于其他3種方法,革蘭陽性菌、革蘭陰性菌檢出率分別為70.1%(35/46)、67.6%(25/37)。見表1。

        表1 4種方法鑒定結果 株

        2.2 4種方法病原菌鑒定不一致結果

        2.2.1 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定 有9例單數(shù)菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗,分別是2株產(chǎn)酸克雷伯菌、2株溶血葡萄球菌,大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、屎腸球菌、變異鏈球菌各1株;常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定全部檢出。有5例混合菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗,分別為1例產(chǎn)酸克雷伯菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌樣本,1例溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌樣本,1例溶血葡萄球菌、屎腸球菌樣本,1例科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌樣本;1例變異鏈球菌、表皮葡萄球菌樣本;常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定全部檢出。見表2。

        表2 4種方法病原菌鑒定不一致結果

        續(xù)表2

        2.2.2 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和平板培養(yǎng) 有9例單數(shù)菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗。這9例樣本中,平板培養(yǎng)鑒定出溶血葡萄球菌和科氏葡萄球菌各1株,其他7例樣本未見菌株生長。2例混合菌樣本平板培養(yǎng)均鑒定出病原菌,1例為產(chǎn)酸克雷伯菌、屎腸球菌和表皮葡萄球菌混合菌樣本,1例為溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌混合菌樣本;這2例混合菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定均未檢出病原菌。見表2。

        2.2.3 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定檢出少動鞘氨醇菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌、緩癥鏈球菌、變異鏈球菌、丙酸桿菌各1株,但分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定未檢出病原菌。5例混合菌樣本2種直接MALDI-TOF MS鑒定均未檢出病原菌。見表2。

        2.2.4 常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定和平板培養(yǎng) 2種方法對2株葡萄球菌的鑒定結果一致,分別是溶血葡萄球菌和科氏葡萄球菌。常規(guī)MALDITOF MS鑒定生長但平板培養(yǎng)未生長的菌株主要為產(chǎn)酸克雷伯菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、科氏葡萄球菌和變異鏈球菌。5例混合菌樣本中,有2例2種方法鑒定結果一致,其他3例平板培養(yǎng)未見菌落生長。見表2。

        2.3 4種方法檢出時間比較

        常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定、平板培養(yǎng)、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOFMS鑒定、HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定4種方法檢出時間分別為45.2 、54.3、9.4、10.2 h。HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定均在14 h內(nèi)檢出微生物,其中11例樣本7 h內(nèi)即檢出微生物,見表3。

        表3 不同時間HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定結果

        3 討論

        本研究結果表明,HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS可鑒定出血培養(yǎng)瓶報陽關節(jié)液樣本中與常規(guī)轉種法鑒定結果相似的微生物,且耗時大大縮短。該方法病原菌鑒定率低于常規(guī)MALDI-TOF MS,有9例未鑒定出微生物,高于分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS法和平板培養(yǎng)法,且鑒定時間大大縮短,對于關節(jié)置換術后人工關節(jié)感染患者的抗感染治療有積極意義,有利于改善患者預后。

        本研究中,HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDITOF MS在關節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物中鑒定出91.9%(34/37)的革蘭陰性菌和86.9%(40/46)的革蘭陽性菌,與之前報道的血流感染直接MALDI-TOF MS鑒定結果一致,即直接MALDITOF MS鑒定對革蘭陰性菌具有較高的鑒定率,對于革蘭陽性菌的鑒定率次之[5-8],原因可能是革蘭陽性菌的細胞壁更堅固,降低了蛋白質(zhì)提取率,使MALDI-TOF MS鑒定受到影響[9-10]。HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定對10.7%(9/84)的關節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物鑒定失敗(其中50%是革蘭陽性球菌),但比分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗率[19.0%(16/84)]低,而常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定成功鑒定出培養(yǎng)物中的所有病原菌。本研究中,常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定出5例多種菌混合感染樣本,但是2種直接MALDI-TOF MS均未鑒定出,原因可能是MALDI-TOF MS鑒定混合菌樣本時,會產(chǎn)生異?;蚨鄻拥牡鞍踪|(zhì)譜,使MALDI-TOF MS無法從其數(shù)據(jù)庫中識別出每個微生物。

        用血培養(yǎng)瓶對人工關節(jié)置換術后關節(jié)液進行培養(yǎng),通常需要3~5 d才能鑒定出病原菌[11-12],無法滿足臨床需求。如果可以較早地鑒定出病原菌,可以更精確地進行有針對性的經(jīng)驗治療,以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。采用MALDI-TOF MS直接鑒定關節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物具有可快速鑒定病原菌的優(yōu)勢。有研究結果表明,直接采用MALDI-TOF MS鑒定陽性血液培養(yǎng)物需7.1 h,比常規(guī)方法的48.1 h明顯縮短[13]。在本研究中,直接MALDI-TOF MS關節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物病原菌鑒定時間為5~14 h,明顯低于常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定的45.2 h和常規(guī)培養(yǎng)的54.3 h。

        綜上所述,直接MALDI-TOF MS可快速鑒定人工關節(jié)置換術后感染患者關節(jié)液樣本中的單個病原菌,聯(lián)合HB&L系統(tǒng),能夠在3 h之內(nèi)提供MALDI-TOF MS所需的菌液沉淀物,大大縮短了鑒定時間,一旦直接MALDI-TOF MS鑒定出病原菌,臨床就可在1 d內(nèi)有針對性地進行經(jīng)驗治療[8]。

        本研究不足之處在于僅收集到1株真菌,雖然3種方法均培養(yǎng)出真菌,但采用直接MALDITOF MS鑒定對真菌的檢出率較低,與相關文獻報道一致[14],后續(xù)將擴大樣本量進一步分析。另外,3種方法均無法進行抗菌藥物敏感性分析,若能進一步提供快速的藥物敏感性試驗報告,將更加有利于指導臨床用藥[15-16]。

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