丁毅偉，韓志海

（解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100084）

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，越來越多的患者選擇人工關(guān)節(jié)置換，感染是手術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，及時進行抗感染治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵，快速、準(zhǔn)確的病原菌鑒定意義重大。但是，關(guān)節(jié)液樣本的培養(yǎng)需要2～3 d，少數(shù)苛養(yǎng)菌和真菌的培養(yǎng)時間更長，甚至需要14 d；將關(guān)節(jié)液放入血培養(yǎng)瓶中進行增菌培養(yǎng)也需要至少8～12 h。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)可快速鑒定報陽血培養(yǎng)樣本中的病原菌，較傳代培養(yǎng)之后對瓊脂上的單個菌落進行常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定，鑒定時間可從平均24.48 h減少到1 h內(nèi)[2-3]。常規(guī)MALDI-TOF MS最耗時的過程是在鑒定之前對樣本進行傳代培養(yǎng)。HB&L微生物培養(yǎng)系統(tǒng)（簡稱HB&L系統(tǒng)，意大利Alifax公司）最初被用于快速篩查尿液樣本中的病原菌，能夠快速增菌培養(yǎng)，采用獨特的光散射技術(shù)實時監(jiān)測麥?zhǔn)蠞舛?，提示細菌生長。有研究結(jié)果表明，HB&L系統(tǒng)可以用于報陽血培養(yǎng)樣本的快速培養(yǎng)，聯(lián)合MALDI-TOF MS，鑒定準(zhǔn)確率和時效性均較高，已被應(yīng)用于血流感染的快速診斷[4]。但將關(guān)節(jié)液樣本置于血培養(yǎng)瓶中，陽性報警后，經(jīng)HB&L系統(tǒng)前處理后直接采用MALDI-TOF MS鑒定病原菌的研究尚不多見。本研究采用MALDI-TOF MS對經(jīng)HB&L系統(tǒng)前處理后的關(guān)節(jié)液樣本進行直接鑒定，并與常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定、平板培養(yǎng)鑒定結(jié)果進行比較，評價直接MALDI-TOF MS與HB&L系統(tǒng)聯(lián)用在快速鑒定血培養(yǎng)瓶報陽關(guān)節(jié)液樣本病原菌中的價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采用無菌方法采集解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后疑似感染患者的關(guān)節(jié)液樣本104例，分別注入需氧血培養(yǎng)瓶和厭氧血培養(yǎng)瓶各10 mL，另外3 mL關(guān)節(jié)液及時送至檢驗科行常規(guī)培養(yǎng)。104例關(guān)節(jié)液樣本中，99例為單一細菌感染，5例為混合菌感染。

1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS儀及配套α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液（德國Bruker公司）；甲酸、無水乙醇、乙腈（美國Sigma-Aldrich公司）；2 mL血培養(yǎng)瓶（意大利Alifax公司）；BacT/A lert 3D自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)和需氧、厭氧血培養(yǎng)瓶（美國貝克曼庫爾特公司）；需氧血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板（鄭州安圖公司）；Insepack ST740CG血清分離膠促凝管（廣州陽普公司）。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定 將已注入關(guān)節(jié)液的需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶置于BacT/A lert 3D自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)，將陽性報警關(guān)節(jié)液分別接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板進行傳代培養(yǎng)，5% CO2環(huán)境下35 ℃孵育18～24 h，挑取單個菌落均勻涂布于靶板上，自然干燥后加入1 μL甲酸，干燥后加基質(zhì)液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.3.2 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定 用無菌注射器將需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶中的陽性菌液抽出2 mL，吸取10 μL轉(zhuǎn)種于HB&L血培養(yǎng)瓶中繼代培養(yǎng)1～3 h，當(dāng)達到1.5麥?zhǔn)蠞舛群螅瑥呐囵B(yǎng)液中取1 mL陽性菌液置于1.5 mL的Eppondorf管中，11 346×g離心2 min，重復(fù)操作2次，取1 μL沉淀均勻涂布于MALDI-TOF MS儀靶板，自然干燥后加1 μL甲酸，干燥后加基質(zhì)液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.3.3 分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定 從報陽血培養(yǎng)瓶中抽取3 mL菌液至Insepack ST740CG血清分離膠促凝管，600×g離心10 min，棄上清液，用無菌棉簽挑取富集在分離膠表面的細菌沉淀物，加入1 000 μL去離子水，混勻后11 346×g離心2 min，重復(fù)操作2次，棄上清，加入500 μL無水乙醇混勻，11 346×g離心2 min，棄上清，室溫環(huán)境開蓋放置2 min，取1 μL沉淀均勻涂布于MALDI-TOF MS儀靶板，晾干后加1 μL甲酸，干燥后加基質(zhì)液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.3.4 平板培養(yǎng) 將無菌注射器收集的3 mL關(guān)節(jié)液充分混合后，分別滴加于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板，5% CO2環(huán)境35 ℃孵育18～24 h，挑取單個菌落均勻涂布于MALDI-TOFMS儀靶板，自然干燥后加1 μL甲酸，干燥后加基質(zhì)液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)MALDI-TOF MS儀說明書要求：＞2.000分，可鑒定到種水平；1.700～1.999分，可鑒定到屬水平；≤1.700分為結(jié)果不可靠；如≤1.700分，但鑒定結(jié)果前3位均屬于同一種菌，也認為結(jié)果正確，否則為結(jié)果不可靠。

2 結(jié)果

2.1 4種方法鑒定結(jié)果比較

99例單一細菌感染樣本中，采用HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定和常規(guī)MALDITOF MS鑒定均有15例陰性，常規(guī)培養(yǎng)有39例陰性。血培養(yǎng)瓶增菌培養(yǎng)陽性樣本中，2種直接MALDI-TOF MS鑒定和常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定檢出率均為84.8%（84/99），平板培養(yǎng)檢出率僅為60.6%（60/99）。

HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的檢出率分別為86.9%（40/46）、91.9%（34/37）。分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的檢出率分別為78.3%（36/46）、83.8%（31/37）。2種直接MALDI-TOF MS鑒定方法檢出的革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為主，革蘭陰性菌以大腸埃希菌為主，有84株病原菌被鑒定至種水平，僅1株白念珠菌被鑒定至屬水平。HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定分別有9例和16例樣本培養(yǎng)出細菌，但鑒定失敗；常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定均鑒定出細菌。平板培養(yǎng)檢出率低于其他3種方法，革蘭陽性菌、革蘭陰性菌檢出率分別為70.1%（35/46）、67.6%（25/37）。見表1。

表1 4種方法鑒定結(jié)果 株

2.2 4種方法病原菌鑒定不一致結(jié)果

2.2.1 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定 有9例單數(shù)菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗，分別是2株產(chǎn)酸克雷伯菌、2株溶血葡萄球菌，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、屎腸球菌、變異鏈球菌各1株；常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定全部檢出。有5例混合菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗，分別為1例產(chǎn)酸克雷伯菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌樣本，1例溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌樣本，1例溶血葡萄球菌、屎腸球菌樣本，1例科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌樣本；1例變異鏈球菌、表皮葡萄球菌樣本；常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定全部檢出。見表2。

表2 4種方法病原菌鑒定不一致結(jié)果

續(xù)表2

2.2.2 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和平板培養(yǎng) 有9例單數(shù)菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗。這9例樣本中，平板培養(yǎng)鑒定出溶血葡萄球菌和科氏葡萄球菌各1株，其他7例樣本未見菌株生長。2例混合菌樣本平板培養(yǎng)均鑒定出病原菌，1例為產(chǎn)酸克雷伯菌、屎腸球菌和表皮葡萄球菌混合菌樣本，1例為溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌混合菌樣本；這2例混合菌樣本HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定均未檢出病原菌。見表2。

2.2.3 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定 HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定檢出少動鞘氨醇菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌、緩癥鏈球菌、變異鏈球菌、丙酸桿菌各1株，但分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定未檢出病原菌。5例混合菌樣本2種直接MALDI-TOF MS鑒定均未檢出病原菌。見表2。

2.2.4 常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定和平板培養(yǎng) 2種方法對2株葡萄球菌的鑒定結(jié)果一致，分別是溶血葡萄球菌和科氏葡萄球菌。常規(guī)MALDITOF MS鑒定生長但平板培養(yǎng)未生長的菌株主要為產(chǎn)酸克雷伯菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、科氏葡萄球菌和變異鏈球菌。5例混合菌樣本中，有2例2種方法鑒定結(jié)果一致，其他3例平板培養(yǎng)未見菌落生長。見表2。

2.3 4種方法檢出時間比較

常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定、平板培養(yǎng)、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOFMS鑒定、HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定4種方法檢出時間分別為45.2 、54.3、9.4、10.2 h。HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定均在14 h內(nèi)檢出微生物，其中11例樣本7 h內(nèi)即檢出微生物，見表3。

表3 不同時間HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果表明，HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS可鑒定出血培養(yǎng)瓶報陽關(guān)節(jié)液樣本中與常規(guī)轉(zhuǎn)種法鑒定結(jié)果相似的微生物，且耗時大大縮短。該方法病原菌鑒定率低于常規(guī)MALDI-TOF MS，有9例未鑒定出微生物，高于分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS法和平板培養(yǎng)法，且鑒定時間大大縮短，對于關(guān)節(jié)置換術(shù)后人工關(guān)節(jié)感染患者的抗感染治療有積極意義，有利于改善患者預(yù)后。

本研究中，HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDITOF MS在關(guān)節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物中鑒定出91.9%（34/37）的革蘭陰性菌和86.9%（40/46）的革蘭陽性菌，與之前報道的血流感染直接MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果一致，即直接MALDITOF MS鑒定對革蘭陰性菌具有較高的鑒定率，對于革蘭陽性菌的鑒定率次之[5-8]，原因可能是革蘭陽性菌的細胞壁更堅固，降低了蛋白質(zhì)提取率，使MALDI-TOF MS鑒定受到影響[9-10]。HB&L系統(tǒng)處理后直接MALDI-TOF MS鑒定對10.7%（9/84）的關(guān)節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物鑒定失敗（其中50%是革蘭陽性球菌），但比分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗率[19.0%（16/84）]低，而常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定成功鑒定出培養(yǎng)物中的所有病原菌。本研究中，常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定出5例多種菌混合感染樣本，但是2種直接MALDI-TOF MS均未鑒定出，原因可能是MALDI-TOF MS鑒定混合菌樣本時，會產(chǎn)生異?；蚨鄻拥牡鞍踪|(zhì)譜，使MALDI-TOF MS無法從其數(shù)據(jù)庫中識別出每個微生物。

用血培養(yǎng)瓶對人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后關(guān)節(jié)液進行培養(yǎng)，通常需要3～5 d才能鑒定出病原菌[11-12]，無法滿足臨床需求。如果可以較早地鑒定出病原菌，可以更精確地進行有針對性的經(jīng)驗治療，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。采用MALDI-TOF MS直接鑒定關(guān)節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物具有可快速鑒定病原菌的優(yōu)勢。有研究結(jié)果表明，直接采用MALDI-TOF MS鑒定陽性血液培養(yǎng)物需7.1 h，比常規(guī)方法的48.1 h明顯縮短[13]。在本研究中，直接MALDI-TOF MS關(guān)節(jié)液陽性血液培養(yǎng)物病原菌鑒定時間為5～14 h，明顯低于常規(guī)MALDI-TOF MS鑒定的45.2 h和常規(guī)培養(yǎng)的54.3 h。

綜上所述，直接MALDI-TOF MS可快速鑒定人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染患者關(guān)節(jié)液樣本中的單個病原菌，聯(lián)合HB&L系統(tǒng)，能夠在3 h之內(nèi)提供MALDI-TOF MS所需的菌液沉淀物，大大縮短了鑒定時間，一旦直接MALDI-TOF MS鑒定出病原菌，臨床就可在1 d內(nèi)有針對性地進行經(jīng)驗治療[8]。

本研究不足之處在于僅收集到1株真菌，雖然3種方法均培養(yǎng)出真菌，但采用直接MALDITOF MS鑒定對真菌的檢出率較低，與相關(guān)文獻報道一致[14]，后續(xù)將擴大樣本量進一步分析。另外，3種方法均無法進行抗菌藥物敏感性分析，若能進一步提供快速的藥物敏感性試驗報告，將更加有利于指導(dǎo)臨床用藥[15-16]。