俞 錢
(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院,江蘇 蘇州 215002)
《醫(yī)院檢驗(yàn)科建設(shè)管理規(guī)范》[1],第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[2],《CNAS—CL02:2012 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則(ISO 15189:2012,IDT)》[3]等均要求實(shí)驗(yàn)室在設(shè)備安裝使用前和使用中驗(yàn)證其能達(dá)到必要的性能。線性是整個檢測系統(tǒng)對應(yīng)于系列分析物濃度與儀器最終輸出的信號間是否比例恒定的性能,是方法學(xué)性能評價的重要指標(biāo)之一。本研究根據(jù)美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(the National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)定量測量方法的線性評價文件——EP6-A[4]和《WS/T408—2012 臨床化學(xué)設(shè)備線性評價指南》[5]要求,使用紅細(xì)胞裂解液制備高濃度白細(xì)胞(white blood cell,WBC)懸液,并對WBC計數(shù)定量檢測方法線性進(jìn)行驗(yàn)證。
選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院健康體檢者100名,用乙二胺四乙酸二鉀真空采血管采集其肘靜脈血2 mL。所有標(biāo)本無溶血、黃疸、脂血。
XE-2100全自動血液分析儀(日本Sysmex公司)及配套試劑;KDC-2046低溫離心機(jī)(安徽中佳公司);氯化氨(分析純)、碳酸氫鉀(分析純)購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,乙二胺四乙酸二鈉(分析純)購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。
1.3.1 驗(yàn)證準(zhǔn)備 按《WS/T347—2011血細(xì)胞分析的校準(zhǔn)指南》[6]要求對XE-2100全自動血液分析儀進(jìn)行校準(zhǔn)。在進(jìn)行線性驗(yàn)證前,本底計數(shù)、攜帶污染率、精密度必須符合《WS/T 406—2012 臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》[7]相關(guān)規(guī)定。
1.3.2 配制紅細(xì)胞裂解液 取碳酸氫鉀1.0 g、氯化氨8.3 g、乙二胺四乙酸二鈉0.037 g,加雙蒸水至1 000 mL,配制成工作液[8]。
1.3.3 制備高濃度白細(xì)胞懸液 (1)將100份體檢者血常規(guī)標(biāo)本,分別裝入15 mL的玻璃試管中,每管加入工作液6 mL,混勻15 min后,400×g離心10 min,棄上清液。(2)每管加入工作液1 mL,混勻,每10管轉(zhuǎn)移至1支玻璃試管中,混勻15 min后,400×g離心10 min,棄上清液。(3)每管加入工作液1 mL,混勻,每5管轉(zhuǎn)移至1支玻璃試管中,混勻15 min后,400×g離心10 min,棄上清液。(4)用0.9%NaCl溶液混懸2支試管中的沉淀,混勻15 min后,400×g離心10 min,棄上清液。(5)重復(fù)步驟(4)3次后,用AB型血漿混懸所得的沉淀,制成5 mL約200×109/L的白細(xì)胞懸液。
1.3.4 分段驗(yàn)證 白細(xì)胞醫(yī)學(xué)決定水平在臨床診斷和治療中具有重要意義[9]。為了覆蓋所有白細(xì)胞醫(yī)學(xué)決定水平,線性驗(yàn)證分低、中、高(0~2.0)×109/L、(2.0~20.0)×109/L、(20.0~200.0)×109/L 3段進(jìn)行驗(yàn)證。
1.3.5 線性范圍評價試驗(yàn) 按NCCLS EP6-A[4]方案將稀釋液(L)標(biāo)記為1號標(biāo)本,制備的高濃度標(biāo)本(H)標(biāo)記為6號標(biāo)本,2、3、4、5號標(biāo)本按0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H體積比配制,每份標(biāo)本重復(fù)測定3次,取均值;先初步檢查數(shù)據(jù),再進(jìn)行離群值檢驗(yàn),然后進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析;以回歸標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error,SE)最小為最適多項(xiàng)式,如最適多項(xiàng)式為一次多項(xiàng)式,則為線性;如為二次或三次多項(xiàng)式,則進(jìn)行t檢驗(yàn),公式為:t=bi/SEi,式中bi為非線性系數(shù)b2或b3,SEi為非線性系數(shù)b2或b3的SE,判斷非線性系數(shù)b2和b3與0的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義,無即為臨床可接受線性,有則為非線性;計算線性偏離,公式為:DLi=p(Xi)-(b0+b1Xi),式中p(Xi)為最適多項(xiàng)式在每個稀釋度處的估計值,b0+b1Xi為擬合線性在每個稀釋度處的估計值;線性偏移=(DLi/b0+b1Xi)× 100%,判斷標(biāo)準(zhǔn)為7.5%,白細(xì)胞計數(shù)為1/2允許總誤差(allowable total error,TEa),如線性偏移<7.5%,則為臨床可接受線性,線性偏移>7.5%,則為非線性。
采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
采用格拉布斯法進(jìn)行離群值檢驗(yàn),計算每個濃度點(diǎn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計量t1、t2,結(jié)果顯示t1<1.135、t2<1.135,沒有離群值,具體結(jié)果見表1。
表1 低、中、高濃度白細(xì)胞懸液線性驗(yàn)證測定結(jié)果
低濃度回歸SE(0.052)最小,以一次多項(xiàng)式為最適多項(xiàng)式,白細(xì)胞計數(shù)在(0.0~2.0)×109/L濃度范圍內(nèi)呈線性。中濃度二次多項(xiàng)式回歸SE(0.189)最小,以二次多項(xiàng)式為最適多項(xiàng)式,對非線性系數(shù)b2進(jìn)行t檢驗(yàn),自由度為15,t=1.056,P=0.369;b2與0比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,白細(xì)胞計數(shù)在(2.0~20.0)×109/L濃度范圍內(nèi)為臨床可接受線性。高濃度三次多項(xiàng)式回歸SE(0.615)最小,以三次多項(xiàng)式為最適多項(xiàng)式,對非線性系數(shù)b2、b3進(jìn)行t檢驗(yàn),自由度為14,b2:t=4.829,P=0.040;b3:t=-5.702,P=0.029;b2、b3與0比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。
表2 低、中、高濃度白細(xì)胞計數(shù)多項(xiàng)式回歸參數(shù)及最適多項(xiàng)式的非線性系數(shù)
續(xù)表2
白細(xì)胞計數(shù)三次多項(xiàng)式與一次多項(xiàng)式估計值最大偏移為4.3%,<7.5%,在臨床可接受誤差允許范圍內(nèi),白細(xì)胞計數(shù)在(20.0~195.0)×109/L范圍內(nèi)為臨床可接受線性。見表3。
表3 高濃度白細(xì)胞計數(shù)三次多項(xiàng)式與一次多項(xiàng)式估計值的線性偏移
臨床工作中,進(jìn)行全血細(xì)胞計數(shù)性能驗(yàn)證時,需要大量高濃度標(biāo)本,有文獻(xiàn)報道用臨床標(biāo)本離心分離白細(xì)胞[10],吸取白細(xì)胞層,進(jìn)一步濃縮獲得高濃度白細(xì)胞懸液,此法要求操作精度較高,對操作人員技術(shù)要求也較高。本研究用紅細(xì)胞裂解液方法獲得高濃度標(biāo)本,來源方便、配制簡單,經(jīng)驗(yàn)證,重復(fù)性好、精密度高,是制備高濃度白細(xì)胞標(biāo)本的理想方法。可以在血細(xì)胞計數(shù)性能驗(yàn)證工作中推廣使用。
目前,一般采用幾個不同濃度標(biāo)本測量2~3次的平均值與實(shí)際值之間是否有趨勢上的線性關(guān)系來進(jìn)行全血細(xì)胞計數(shù)線性驗(yàn)證,r≥0.975,斜率為0.95~1.05,則驗(yàn)證呈線性,這一方法簡單、適用,但不太科學(xué)。本研究采用多項(xiàng)式回歸分析,先判斷非線性多項(xiàng)式擬合數(shù)據(jù)是否比線性好,如非線性多項(xiàng)式擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)比線性好,再對各個數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行非線性評估,判斷最適多項(xiàng)式與線性擬合之間的線性偏移是否<1/2 TEa,當(dāng)評價結(jié)果統(tǒng)計學(xué)上為非線性時,若采用線性方式處理患者檢測結(jié)果,引入的誤差在臨床允許誤差范圍內(nèi),則為臨床可接受線性,可按線性處理結(jié)果,這一方法雖然驗(yàn)證過程較為繁瑣,但更科學(xué)、合理,且更有說服力。NCCLS EP6-A文件[1]推薦的方法利用統(tǒng)計學(xué)原理保證了結(jié)果的準(zhǔn)確和客觀,將線性評價與臨床目標(biāo)完美結(jié)合,更適合臨床應(yīng)用。