俞 錢

（南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院，江蘇 蘇州 215002）

《醫(yī)院檢驗科建設管理規(guī)范》[1]，第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[2]，《CNAS—CL02：2012 醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則（ISO 15189：2012，IDT）》[3]等均要求實驗室在設備安裝使用前和使用中驗證其能達到必要的性能。線性是整個檢測系統(tǒng)對應于系列分析物濃度與儀器最終輸出的信號間是否比例恒定的性能，是方法學性能評價的重要指標之一。本研究根據(jù)美國國家臨床實驗室標準委員會（the National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）定量測量方法的線性評價文件——EP6-A[4]和《WS/T408—2012 臨床化學設備線性評價指南》[5]要求，使用紅細胞裂解液制備高濃度白細胞（white blood cell，WBC）懸液，并對WBC計數(shù)定量檢測方法線性進行驗證。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院健康體檢者100名，用乙二胺四乙酸二鉀真空采血管采集其肘靜脈血2 mL。所有標本無溶血、黃疸、脂血。

1.2 儀器與試劑

XE-2100全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑；KDC-2046低溫離心機（安徽中佳公司）；氯化氨（分析純）、碳酸氫鉀（分析純）購自天津致遠化學試劑有限公司，乙二胺四乙酸二鈉（分析純）購自天津市大茂化學試劑廠。

1.3 方法

1.3.1 驗證準備 按《WS/T347—2011血細胞分析的校準指南》[6]要求對XE-2100全自動血液分析儀進行校準。在進行線性驗證前，本底計數(shù)、攜帶污染率、精密度必須符合《WS/T 406—2012 臨床血液學檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》[7]相關規(guī)定。

1.3.2 配制紅細胞裂解液 取碳酸氫鉀1.0 g、氯化氨8.3 g、乙二胺四乙酸二鈉0.037 g，加雙蒸水至1 000 mL，配制成工作液[8]。

1.3.3 制備高濃度白細胞懸液 （1）將100份體檢者血常規(guī)標本，分別裝入15 mL的玻璃試管中，每管加入工作液6 mL，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（2）每管加入工作液1 mL，混勻，每10管轉(zhuǎn)移至1支玻璃試管中，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（3）每管加入工作液1 mL，混勻，每5管轉(zhuǎn)移至1支玻璃試管中，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（4）用0.9%NaCl溶液混懸2支試管中的沉淀，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（5）重復步驟（4）3次后，用AB型血漿混懸所得的沉淀，制成5 mL約200×109/L的白細胞懸液。

1.3.4 分段驗證 白細胞醫(yī)學決定水平在臨床診斷和治療中具有重要意義[9]。為了覆蓋所有白細胞醫(yī)學決定水平，線性驗證分低、中、高（0～2.0）×109/L、（2.0～20.0）×109/L、（20.0～200.0）×109/L 3段進行驗證。

1.3.5 線性范圍評價試驗 按NCCLS EP6-A[4]方案將稀釋液（L）標記為1號標本，制備的高濃度標本（H）標記為6號標本，2、3、4、5號標本按0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H體積比配制，每份標本重復測定3次，取均值；先初步檢查數(shù)據(jù)，再進行離群值檢驗，然后進行多項式回歸分析；以回歸標準誤（standard error，SE）最小為最適多項式，如最適多項式為一次多項式，則為線性；如為二次或三次多項式，則進行t檢驗，公式為：t=bi/SEi，式中bi為非線性系數(shù)b2或b3，SEi為非線性系數(shù)b2或b3的SE，判斷非線性系數(shù)b2和b3與0的差異是否有統(tǒng)計學意義，無即為臨床可接受線性，有則為非線性；計算線性偏離，公式為：DLi=p（Xi）-（b0+b1Xi），式中p（Xi）為最適多項式在每個稀釋度處的估計值，b0+b1Xi為擬合線性在每個稀釋度處的估計值；線性偏移=（DLi/b0+b1Xi）× 100%，判斷標準為7.5%，白細胞計數(shù)為1/2允許總誤差（allowable total error，TEa），如線性偏移＜7.5%，則為臨床可接受線性，線性偏移＞7.5%，則為非線性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 低、中、高濃度白細胞懸液測定結果

采用格拉布斯法進行離群值檢驗，計算每個濃度點數(shù)據(jù)統(tǒng)計量t1、t2，結果顯示t1＜1.135、t2＜1.135，沒有離群值，具體結果見表1。

表1 低、中、高濃度白細胞懸液線性驗證測定結果

2.2 低、中、高濃度多項式回歸分析

低濃度回歸SE（0.052）最小，以一次多項式為最適多項式，白細胞計數(shù)在（0.0～2.0）×109/L濃度范圍內(nèi)呈線性。中濃度二次多項式回歸SE（0.189）最小，以二次多項式為最適多項式，對非線性系數(shù)b2進行t檢驗，自由度為15，t=1.056，P=0.369；b2與0比較差異無統(tǒng)計學意義，白細胞計數(shù)在（2.0～20.0）×109/L濃度范圍內(nèi)為臨床可接受線性。高濃度三次多項式回歸SE（0.615）最小，以三次多項式為最適多項式，對非線性系數(shù)b2、b3進行t檢驗，自由度為14，b2：t=4.829，P=0.040；b3：t=-5.702，P=0.029；b2、b3與0比較差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 低、中、高濃度白細胞計數(shù)多項式回歸參數(shù)及最適多項式的非線性系數(shù)

續(xù)表2

2.3 高濃度白細胞計數(shù)三次多項式與一次多項式估計值的偏移

白細胞計數(shù)三次多項式與一次多項式估計值最大偏移為4.3%，＜7.5%，在臨床可接受誤差允許范圍內(nèi)，白細胞計數(shù)在（20.0～195.0）×109/L范圍內(nèi)為臨床可接受線性。見表3。

表3 高濃度白細胞計數(shù)三次多項式與一次多項式估計值的線性偏移

3 討論

臨床工作中，進行全血細胞計數(shù)性能驗證時，需要大量高濃度標本，有文獻報道用臨床標本離心分離白細胞[10]，吸取白細胞層，進一步濃縮獲得高濃度白細胞懸液，此法要求操作精度較高，對操作人員技術要求也較高。本研究用紅細胞裂解液方法獲得高濃度標本，來源方便、配制簡單，經(jīng)驗證，重復性好、精密度高，是制備高濃度白細胞標本的理想方法?？梢栽谘毎嫈?shù)性能驗證工作中推廣使用。

目前，一般采用幾個不同濃度標本測量2～3次的平均值與實際值之間是否有趨勢上的線性關系來進行全血細胞計數(shù)線性驗證，r≥0.975，斜率為0.95～1.05，則驗證呈線性，這一方法簡單、適用，但不太科學。本研究采用多項式回歸分析，先判斷非線性多項式擬合數(shù)據(jù)是否比線性好，如非線性多項式擬合數(shù)據(jù)點比線性好，再對各個數(shù)據(jù)點進行非線性評估，判斷最適多項式與線性擬合之間的線性偏移是否＜1/2 TEa，當評價結果統(tǒng)計學上為非線性時，若采用線性方式處理患者檢測結果，引入的誤差在臨床允許誤差范圍內(nèi)，則為臨床可接受線性，可按線性處理結果，這一方法雖然驗證過程較為繁瑣，但更科學、合理，且更有說服力。NCCLS EP6-A文件[1]推薦的方法利用統(tǒng)計學原理保證了結果的準確和客觀，將線性評價與臨床目標完美結合，更適合臨床應用。