周毓菁，徐晶晶，徐 杰，劉冬梅，何 軍

（蘇州大學附屬第一醫(yī)院臨床檢測中心，江蘇 蘇州 215000）

弓形蟲病是由弓形蟲感染引起的一種人畜共患寄生蟲病，貓科動物為其終宿主和重要的傳染源，中間宿主包括多種哺乳類動物、禽類和人類等。人類會因接觸患弓形蟲病動物的糞便或誤食含有弓形蟲卵囊的生肉而感染弓形蟲病[1]。全球弓形蟲感染率約為30%[2]，我國弓形蟲感染率為7.9%[3]。弓形蟲主要寄生在有核細胞內(nèi)，在人體內(nèi)多為隱性感染。目前應(yīng)用較為廣泛的弓形蟲檢測方法為血清學檢測，如采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等方法檢測抗體或循環(huán)抗原[4-5]，但血清學檢測方法的敏感性不足，易造成漏診，且無法直接進行病原學檢測。本研究擬探討高通量測序[又稱下一代測序（next-generation sequencing，NGS）]技術(shù)在慢性腎臟病5期行腹膜透析患者剛地弓形蟲感染診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 病例資料

患者，女，53歲，因“反復腹痛5年余，發(fā)現(xiàn)腹膜透析液渾濁4 d”于2018年8月17日入住蘇州大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科?；颊哂?年前出現(xiàn)腹痛伴尿液減少，實驗室檢查示：血肌酐310 μmol/L，尿蛋白陽性；B超檢查示：雙腎萎縮。診斷為腎功能不全。予以護腎治療后，血肌酐仍逐步升高，最高為706.7 μmol/L，于2018年7月9日起在蘇州大學附屬第一醫(yī)院行規(guī)律腹膜透析治療。2018年8月14日行腹膜透析液常規(guī)檢查時發(fā)現(xiàn)透明度微混，有核細胞計數(shù)為146×106/L，囑患者住院治療。

患者既往有高血壓病史10余年，口服硝苯地平控釋片和鹽酸阿羅洛爾片進行降壓治療，無糖尿病、冠心病等慢性病史。查體：雙肺呼吸音清，未聞及明顯干、濕性啰音，腹膨隆，肝脾肋下未及，無明顯壓痛、反跳痛，移動性濁音（+），腸鳴音4～5次/min，雙腎區(qū)無明顯叩痛，余體征無明顯異常。臨床診斷為慢性腎臟病合伴腹痛，原因待查。

1.2 樣本來源及類型

2018年9月—2019年7月，臨床分別送檢該患者17份腹膜透析液和腹水樣本，其中包括進行NGS檢測的2份腹水樣本和4份腹膜透析液樣本。同時送檢外周血樣本用于血細胞分析和弓形蟲抗體等檢測。本例患者簽署知情同意書，同意樣本僅用于臨床研究。

1.3 實驗室檢查

1.3.1 腹水及腹膜透析液常規(guī)檢查 采用XN-10（B4）血液分析儀（日本SYSMEX公司）的體液模式及配套試劑進行腹水和腹膜透析液細胞計數(shù)和細胞分類檢測，所有操作嚴格按照儀器說明書進行。另取腹膜透析液5 mL，440×g離心10 min，棄上清，取沉渣直接鏡檢、碘液染色鏡檢（取沉渣1滴，加碘液1滴，顯微鏡下直接觀察）、瑞氏染色鏡檢（取沉渣1滴，涂成薄片，干燥后行瑞氏染色鏡檢）[6]。

1.3.2 腹水及腹膜透析液微生物培養(yǎng) 對腹水及腹膜透析液樣本進行常規(guī)細菌培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基分別為哥倫比亞血平板（鄭州安圖公司）和沙保弱平板[貝瑞特生物技術(shù)（鄭州）有限責任公司]，分別置于35 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周。

1.3.3 血清弓形蟲抗體檢查 采用LIAISON XL全自動化學發(fā)光免疫分析儀（意大利索靈公司）及配套試劑檢測血清弓形蟲 IgG和IgM抗體，嚴格按儀器和試劑說明書進行操作。

1.3.4 NGS測定及數(shù)據(jù)分析 NGS檢測及數(shù)據(jù)分析均在蘇州大學附屬第一醫(yī)院與南京世和基因生物技術(shù)股份有限公司NGS聯(lián)合實驗室內(nèi)完成。取2份腹水和4份腹膜透析液樣本各5 mL。2份腹水樣本沉淀后，采用大體積核酸提取試劑盒（磁珠法）[天根生化科技（北京）有限公司]從上清液中提取游離DNA，從細胞混懸液中提取混懸DNA；提取4份腹膜透析液樣本中的混懸DNA。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測DNA濃度和純度。對DNA進行隨機片段化、文庫構(gòu)建（末端修復、連接接頭、擴增純化）、文庫質(zhì)控、定量pooling后，采用NextSeq 550Dx基因測序儀（美國Illumina公司）測序。從NCBI參考基因組數(shù)據(jù)庫RefSeq和GenBank數(shù)據(jù)庫下載病原微生物基因組序列，該數(shù)據(jù)庫包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲。從UCSC數(shù)據(jù)庫下載人GRCh37參考基因組序列，作為宿主參考序列。對人類基因組的序列進行去宿主處理，將非宿主序列與已知序列的數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.4 臨床治療

患者入院后，考慮腹膜透析性腹膜炎，予以萬古霉素1.0 g留腹治療4次。腹膜透析液中發(fā)現(xiàn)疑似弓形蟲滋養(yǎng)體后，給予奧硝唑0.5 g，q 12 h×10 d治療。

2 結(jié)果

2.1 腹水及腹膜透析液常規(guī)檢查

2018年8月31日送檢的腹膜透析液樣本為無色微混，有核細胞計數(shù)為205×106/L，嗜酸性粒細胞百分比為50%。李凡他試驗陰性。顯微鏡鏡檢找到異常病原體。沉渣直接鏡檢可見一些呈圓形或類圓形、體積為白細胞幾倍大的假包囊，囊內(nèi)含較多活動滋養(yǎng)體（又稱速殖子）。碘液染色鏡檢可見棕黃色圓形或類圓形的假包囊，內(nèi)含1～4個圓形不著色結(jié)構(gòu)。瑞氏染色鏡檢可見假包囊結(jié)構(gòu)呈紫紅色，形態(tài)多樣，呈圓形、橢圓形、毛刺狀、不規(guī)則形等，內(nèi)含數(shù)個紅色細胞核和偏于一側(cè)的半月形滋養(yǎng)體。見圖1。

圖1 腹膜透析液顯微鏡鏡檢（×400）

根據(jù)病原體形態(tài)特點判斷為疑似阿米巴滋養(yǎng)體、弓形蟲滋養(yǎng)體，不排除其他類型原蟲感染。

2.2 腹水及腹膜透析液微生物培養(yǎng)

2份腹水和4份腹膜透析液樣本常規(guī)細菌和真菌培養(yǎng)結(jié)果均為無菌生長。

2.3 血清弓形蟲抗體檢查

本例患者分別于2018年12月29日和2019年7月25日進行2次血清弓形蟲IgM和IgG抗體檢測，結(jié)果均＜3.00 AU/mL（參考區(qū)間＜8 AU/mL），判定為陰性。

2.4 NGS檢測結(jié)果

不同時間送檢的腹水和腹膜透析液樣本不同類型DNA測序結(jié)果和分析見表1。將測序得到的有效序列進行數(shù)據(jù)庫比對，確認檢出的有效序列均為特異性剛地弓形蟲序列。

表1 不同送檢時間送檢的腹水和腹膜透析液樣本NGS測序結(jié)果

2.5 出院后復查

患者出院2個月后復查結(jié)果顯示，腹膜透析液清晰，有核細胞計數(shù)為9×106/L，嗜酸性粒細胞比例接近0，鏡檢未見假包囊結(jié)構(gòu)，NGS結(jié)果未見病原體。

3 討論

剛地弓形蟲是一種常見的專性細胞內(nèi)機會致病性原蟲，屬于孢子蟲綱、真球蟲目、弓形蟲科。弓形蟲在免疫功能正常的機體中多為隱性感染，缺乏特異性的臨床癥狀和體征。弓形蟲感染的病原學檢測主要有直接鏡檢、抗體檢測等，但往往存在假陰性，無法確診[7]。本例患者腹水及腹膜透析液中有核細胞計數(shù)為（100～200）×106/L，嗜酸性粒細胞百分比高達50%，鏡檢可看到疑似弓形蟲滋養(yǎng)體，提示可能寄生蟲感染，而弓形蟲抗體檢測為陰性，故需要有一種更準確的檢測方法來明確診斷。

NGS技術(shù)具有通量高、周期短和準確性、特異性、敏感性高等優(yōu)勢，目前已經(jīng)納入的病原體數(shù)據(jù)庫包括3 000余種細菌、4 000余種病毒、200余種真菌和140種寄生蟲，為臨床病原微生物，尤其是罕見病原微生物感染的診斷提供了更有效的方法[8]。本研究采用NGS技術(shù)直接從患者腹水及腹膜透析液樣本中檢測到病原微生物的基因序列，通過生物信息學分析，明確為剛地弓形蟲基因組，從而實現(xiàn)了對病原微生物的準確診斷。但本研究結(jié)果也顯示，不同樣本來源、不同的DNA類型（游離DNA和混懸DNA）對檢測結(jié)果有明顯影響。因此，樣本采集、核酸提取的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)庫的不斷升級是NGS技術(shù)規(guī)范化、標準化的關(guān)鍵。只有降低NGS檢測的假陰性率，才能提高其對危重、疑難病例的診斷能力。

WILSON等[9]在2014年采用NGS技術(shù)在1例嚴重聯(lián)合免疫缺陷患者的腦脊液中檢出鉤端螺旋體，指導臨床進行有效的靶向藥物治療，為NGS技術(shù)在診斷病原微生物感染中的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本例患者入院后，臨床根據(jù)經(jīng)驗給予萬古霉素1.0 g，分別于2018年8月17日、8月20日、8月23日、8月27日留腹治療，并維持萬古霉素腹膜透析液濃度穩(wěn)定。在治療過程中多次行腹膜透析液常規(guī)檢測，有核細胞計數(shù)始終維持在（100～213）×106/L，嗜酸性粒細胞百分比為47%～58%，提示萬古霉素抗感染治療效果欠佳。采用NGS技術(shù)檢測腹水和腹膜透析液樣本，結(jié)合顯微鏡鏡檢結(jié)果，建議臨床使用奧硝唑0.5 g，每12 h靜脈給藥治療。10 d后，腹膜透析液有核細胞數(shù)和嗜酸性粒細胞百分比逐漸下降，至出院時分別降至8×106/L和8%。顯微鏡鏡檢示假包囊結(jié)構(gòu)從原來的每個視野均可見，到幾百個視野偶見1個，直至找不到，提示治療有效。出院2個月后復查，腹膜透析液清晰，有核細胞計數(shù)為9×106/L，嗜酸性粒細胞百分比接近0，鏡檢未見假包囊結(jié)構(gòu)，NGS檢測未見病原體。證明了NGS為疑難疾病的診斷及治療提供了強有力的依據(jù)。

NGS技術(shù)原則上可對樣本中任何微生物的遺傳物質(zhì)進行鑒定，克服了常規(guī)診斷方法如鏡檢或微生物培養(yǎng)繁瑣、耗時、敏感性和特異性較低的局限性。尤其是對于長期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀的不明原因感染或疼痛、人畜共患感染性疾病、罕見或特殊病原體感染、傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復陰性且治療效果不佳等情況，NGS技術(shù)體現(xiàn)出了前所未有的優(yōu)勢，可高效、快速、準確地診斷病原體[10-11]。因此，NGS技術(shù)在臨床病原微生物感染診斷方面具有顯著的優(yōu)勢和較大的應(yīng)用前景。