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        高通量測序技術(shù)在慢性腎病患者剛地弓形蟲感染診斷中的價(jià)值

        2021-06-26 03:19:14周毓菁徐晶晶劉冬梅
        檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:弓形蟲透析液腹水

        周毓菁,徐晶晶,徐 杰,劉冬梅,何 軍

        (蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測中心,江蘇 蘇州 215000)

        弓形蟲病是由弓形蟲感染引起的一種人畜共患寄生蟲病,貓科動(dòng)物為其終宿主和重要的傳染源,中間宿主包括多種哺乳類動(dòng)物、禽類和人類等。人類會(huì)因接觸患弓形蟲病動(dòng)物的糞便或誤食含有弓形蟲卵囊的生肉而感染弓形蟲病[1]。全球弓形蟲感染率約為30%[2],我國弓形蟲感染率為7.9%[3]。弓形蟲主要寄生在有核細(xì)胞內(nèi),在人體內(nèi)多為隱性感染。目前應(yīng)用較為廣泛的弓形蟲檢測方法為血清學(xué)檢測,如采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等方法檢測抗體或循環(huán)抗原[4-5],但血清學(xué)檢測方法的敏感性不足,易造成漏診,且無法直接進(jìn)行病原學(xué)檢測。本研究擬探討高通量測序[又稱下一代測序(next-generation sequencing,NGS)]技術(shù)在慢性腎臟病5期行腹膜透析患者剛地弓形蟲感染診斷中的價(jià)值。

        1 材料和方法

        1.1 病例資料

        患者,女,53歲,因“反復(fù)腹痛5年余,發(fā)現(xiàn)腹膜透析液渾濁4 d”于2018年8月17日入住蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科?;颊哂?年前出現(xiàn)腹痛伴尿液減少,實(shí)驗(yàn)室檢查示:血肌酐310 μmol/L,尿蛋白陽性;B超檢查示:雙腎萎縮。診斷為腎功能不全。予以護(hù)腎治療后,血肌酐仍逐步升高,最高為706.7 μmol/L,于2018年7月9日起在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院行規(guī)律腹膜透析治療。2018年8月14日行腹膜透析液常規(guī)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)透明度微混,有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為146×106/L,囑患者住院治療。

        患者既往有高血壓病史10余年,口服硝苯地平控釋片和鹽酸阿羅洛爾片進(jìn)行降壓治療,無糖尿病、冠心病等慢性病史。查體:雙肺呼吸音清,未聞及明顯干、濕性啰音,腹膨隆,肝脾肋下未及,無明顯壓痛、反跳痛,移動(dòng)性濁音(+),腸鳴音4~5次/min,雙腎區(qū)無明顯叩痛,余體征無明顯異常。臨床診斷為慢性腎臟病合伴腹痛,原因待查。

        1.2 樣本來源及類型

        2018年9月—2019年7月,臨床分別送檢該患者17份腹膜透析液和腹水樣本,其中包括進(jìn)行NGS檢測的2份腹水樣本和4份腹膜透析液樣本。同時(shí)送檢外周血樣本用于血細(xì)胞分析和弓形蟲抗體等檢測。本例患者簽署知情同意書,同意樣本僅用于臨床研究。

        1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

        1.3.1 腹水及腹膜透析液常規(guī)檢查 采用XN-10(B4)血液分析儀(日本SYSMEX公司)的體液模式及配套試劑進(jìn)行腹水和腹膜透析液細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類檢測,所有操作嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行。另取腹膜透析液5 mL,440×g離心10 min,棄上清,取沉渣直接鏡檢、碘液染色鏡檢(取沉渣1滴,加碘液1滴,顯微鏡下直接觀察)、瑞氏染色鏡檢(取沉渣1滴,涂成薄片,干燥后行瑞氏染色鏡檢)[6]。

        1.3.2 腹水及腹膜透析液微生物培養(yǎng) 對腹水及腹膜透析液樣本進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和真菌培養(yǎng),培養(yǎng)基分別為哥倫比亞血平板(鄭州安圖公司)和沙保弱平板[貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司],分別置于35 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周。

        1.3.3 血清弓形蟲抗體檢查 采用LIAISON XL全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(意大利索靈公司)及配套試劑檢測血清弓形蟲 IgG和IgM抗體,嚴(yán)格按儀器和試劑說明書進(jìn)行操作。

        1.3.4 NGS測定及數(shù)據(jù)分析 NGS檢測及數(shù)據(jù)分析均在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院與南京世和基因生物技術(shù)股份有限公司NGS聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。取2份腹水和4份腹膜透析液樣本各5 mL。2份腹水樣本沉淀后,采用大體積核酸提取試劑盒(磁珠法)[天根生化科技(北京)有限公司]從上清液中提取游離DNA,從細(xì)胞混懸液中提取混懸DNA;提取4份腹膜透析液樣本中的混懸DNA。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國ThermoFisher Scientific公司)檢測DNA濃度和純度。對DNA進(jìn)行隨機(jī)片段化、文庫構(gòu)建(末端修復(fù)、連接接頭、擴(kuò)增純化)、文庫質(zhì)控、定量pooling后,采用NextSeq 550Dx基因測序儀(美國Illumina公司)測序。從NCBI參考基因組數(shù)據(jù)庫RefSeq和GenBank數(shù)據(jù)庫下載病原微生物基因組序列,該數(shù)據(jù)庫包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲。從UCSC數(shù)據(jù)庫下載人GRCh37參考基因組序列,作為宿主參考序列。對人類基因組的序列進(jìn)行去宿主處理,將非宿主序列與已知序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

        1.4 臨床治療

        患者入院后,考慮腹膜透析性腹膜炎,予以萬古霉素1.0 g留腹治療4次。腹膜透析液中發(fā)現(xiàn)疑似弓形蟲滋養(yǎng)體后,給予奧硝唑0.5 g,q 12 h×10 d治療。

        2 結(jié)果

        2.1 腹水及腹膜透析液常規(guī)檢查

        2018年8月31日送檢的腹膜透析液樣本為無色微混,有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為205×106/L,嗜酸性粒細(xì)胞百分比為50%。李凡他試驗(yàn)陰性。顯微鏡鏡檢找到異常病原體。沉渣直接鏡檢可見一些呈圓形或類圓形、體積為白細(xì)胞幾倍大的假包囊,囊內(nèi)含較多活動(dòng)滋養(yǎng)體(又稱速殖子)。碘液染色鏡檢可見棕黃色圓形或類圓形的假包囊,內(nèi)含1~4個(gè)圓形不著色結(jié)構(gòu)。瑞氏染色鏡檢可見假包囊結(jié)構(gòu)呈紫紅色,形態(tài)多樣,呈圓形、橢圓形、毛刺狀、不規(guī)則形等,內(nèi)含數(shù)個(gè)紅色細(xì)胞核和偏于一側(cè)的半月形滋養(yǎng)體。見圖1。

        圖1 腹膜透析液顯微鏡鏡檢(×400)

        根據(jù)病原體形態(tài)特點(diǎn)判斷為疑似阿米巴滋養(yǎng)體、弓形蟲滋養(yǎng)體,不排除其他類型原蟲感染。

        2.2 腹水及腹膜透析液微生物培養(yǎng)

        2份腹水和4份腹膜透析液樣本常規(guī)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)結(jié)果均為無菌生長。

        2.3 血清弓形蟲抗體檢查

        本例患者分別于2018年12月29日和2019年7月25日進(jìn)行2次血清弓形蟲IgM和IgG抗體檢測,結(jié)果均<3.00 AU/mL(參考區(qū)間<8 AU/mL),判定為陰性。

        2.4 NGS檢測結(jié)果

        不同時(shí)間送檢的腹水和腹膜透析液樣本不同類型DNA測序結(jié)果和分析見表1。將測序得到的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對,確認(rèn)檢出的有效序列均為特異性剛地弓形蟲序列。

        表1 不同送檢時(shí)間送檢的腹水和腹膜透析液樣本NGS測序結(jié)果

        2.5 出院后復(fù)查

        患者出院2個(gè)月后復(fù)查結(jié)果顯示,腹膜透析液清晰,有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為9×106/L,嗜酸性粒細(xì)胞比例接近0,鏡檢未見假包囊結(jié)構(gòu),NGS結(jié)果未見病原體。

        3 討論

        剛地弓形蟲是一種常見的專性細(xì)胞內(nèi)機(jī)會(huì)致病性原蟲,屬于孢子蟲綱、真球蟲目、弓形蟲科。弓形蟲在免疫功能正常的機(jī)體中多為隱性感染,缺乏特異性的臨床癥狀和體征。弓形蟲感染的病原學(xué)檢測主要有直接鏡檢、抗體檢測等,但往往存在假陰性,無法確診[7]。本例患者腹水及腹膜透析液中有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為(100~200)×106/L,嗜酸性粒細(xì)胞百分比高達(dá)50%,鏡檢可看到疑似弓形蟲滋養(yǎng)體,提示可能寄生蟲感染,而弓形蟲抗體檢測為陰性,故需要有一種更準(zhǔn)確的檢測方法來明確診斷。

        NGS技術(shù)具有通量高、周期短和準(zhǔn)確性、特異性、敏感性高等優(yōu)勢,目前已經(jīng)納入的病原體數(shù)據(jù)庫包括3 000余種細(xì)菌、4 000余種病毒、200余種真菌和140種寄生蟲,為臨床病原微生物,尤其是罕見病原微生物感染的診斷提供了更有效的方法[8]。本研究采用NGS技術(shù)直接從患者腹水及腹膜透析液樣本中檢測到病原微生物的基因序列,通過生物信息學(xué)分析,明確為剛地弓形蟲基因組,從而實(shí)現(xiàn)了對病原微生物的準(zhǔn)確診斷。但本研究結(jié)果也顯示,不同樣本來源、不同的DNA類型(游離DNA和混懸DNA)對檢測結(jié)果有明顯影響。因此,樣本采集、核酸提取的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)庫的不斷升級是NGS技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵。只有降低NGS檢測的假陰性率,才能提高其對危重、疑難病例的診斷能力。

        WILSON等[9]在2014年采用NGS技術(shù)在1例嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷患者的腦脊液中檢出鉤端螺旋體,指導(dǎo)臨床進(jìn)行有效的靶向藥物治療,為NGS技術(shù)在診斷病原微生物感染中的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本例患者入院后,臨床根據(jù)經(jīng)驗(yàn)給予萬古霉素1.0 g,分別于2018年8月17日、8月20日、8月23日、8月27日留腹治療,并維持萬古霉素腹膜透析液濃度穩(wěn)定。在治療過程中多次行腹膜透析液常規(guī)檢測,有核細(xì)胞計(jì)數(shù)始終維持在(100~213)×106/L,嗜酸性粒細(xì)胞百分比為47%~58%,提示萬古霉素抗感染治療效果欠佳。采用NGS技術(shù)檢測腹水和腹膜透析液樣本,結(jié)合顯微鏡鏡檢結(jié)果,建議臨床使用奧硝唑0.5 g,每12 h靜脈給藥治療。10 d后,腹膜透析液有核細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞百分比逐漸下降,至出院時(shí)分別降至8×106/L和8%。顯微鏡鏡檢示假包囊結(jié)構(gòu)從原來的每個(gè)視野均可見,到幾百個(gè)視野偶見1個(gè),直至找不到,提示治療有效。出院2個(gè)月后復(fù)查,腹膜透析液清晰,有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為9×106/L,嗜酸性粒細(xì)胞百分比接近0,鏡檢未見假包囊結(jié)構(gòu),NGS檢測未見病原體。證明了NGS為疑難疾病的診斷及治療提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。

        NGS技術(shù)原則上可對樣本中任何微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定,克服了常規(guī)診斷方法如鏡檢或微生物培養(yǎng)繁瑣、耗時(shí)、敏感性和特異性較低的局限性。尤其是對于長期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀的不明原因感染或疼痛、人畜共患感染性疾病、罕見或特殊病原體感染、傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復(fù)陰性且治療效果不佳等情況,NGS技術(shù)體現(xiàn)出了前所未有的優(yōu)勢,可高效、快速、準(zhǔn)確地診斷病原體[10-11]。因此,NGS技術(shù)在臨床病原微生物感染診斷方面具有顯著的優(yōu)勢和較大的應(yīng)用前景。

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