王淑琪 孫克寒 陳 菲 高 照 林繄依 楊漫芳 許心蕊 聶 波

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 l00700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院后勤保障處，北京 100700

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是由于動(dòng)脈壁上的脂質(zhì)沉積，使動(dòng)脈管腔形成斑塊并變窄的病變，是導(dǎo)致心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，對(duì)人體健康具有巨大威脅[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥如黃連、黃芩、金銀花、甘草、丹參、玄參、當(dāng)歸等[2-5]均具有抗AS 的作用。中藥藥對(duì)的有效配伍可發(fā)揮增效減毒的作用，其中“金銀花-玄參”作為四妙勇安湯中的君藥和臣藥，在復(fù)方中用量較大，對(duì)抗AS 具有顯著作用[6]。金銀花乃甘寒之品，為疏散風(fēng)熱、清熱解毒之要藥；玄參性微寒，為清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)之要藥[7-8]。此藥對(duì)具有抗炎、抗氧化、降血壓、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善AS 等藥理作用，主要的化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類、有機(jī)酸類、黃酮類等[9-10]。

本文中的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是借助數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)資料及前期課題實(shí)驗(yàn)研究[11-12]，利用大量的生物學(xué)信息，對(duì)現(xiàn)有的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從多方面闡釋中藥的活性成分與疾病之間的交互作用，為多成分、多靶點(diǎn)、多通路的中藥作用機(jī)制研究和藥效物質(zhì)研究提供依據(jù)[13]。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建“金銀花-玄參”藥對(duì)的“藥物-成分-疾病-靶標(biāo)-信號(hào)通路”交互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合GO 生物過(guò)程分析及KEGG 通路富集分析，開(kāi)展“金銀花-玄參”藥對(duì)治療AS 的分子作用機(jī)制研究。

1 資料與方法

1.1 靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

1.1.1 活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選及活性成分-靶點(diǎn)的構(gòu)建 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）[14]檢索金銀花、玄參中的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 作為篩選條件[15-16]。除此之外，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，篩選金銀花和玄參中因上述篩選條件而被刪除的但對(duì)抗AS 的研究有一定藥理活性的化學(xué)成分。同樣基于TCMSP平臺(tái)，通過(guò)檢索獲得藥對(duì)中活性成分所作用的靶標(biāo)。將上述金銀花-玄參各藥物的活性成分及藥物潛在靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.0 軟件進(jìn)行活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

1.1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)DisGeNET[17]、OMIM[18]、GeneCards[19]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲得AS 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，將獲得的疾病靶點(diǎn)與“金銀花-玄參”有效成分的靶標(biāo)進(jìn)行比對(duì)取交集，得到“金銀花-玄參”藥對(duì)治療AS 的作用靶點(diǎn)用于后續(xù)的研究。

1.1.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化及交互關(guān)系構(gòu)建將上述獲得的藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)名稱上傳到Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。利用Venny 2.1 軟件將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，再用String 11.0 平臺(tái)將交集分析后篩選到的共有靶標(biāo)建立藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)交互作用關(guān)系，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行分析。

1.1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治龊秃诵陌悬c(diǎn)的篩選 利用Cytoscape 軟件中的BisoGenet、CytoNCA 和CytoHubba 插件對(duì)上述得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過(guò)調(diào)節(jié)degree 下限值至合適的數(shù)值篩選核心靶點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

將上述篩選出的PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)導(dǎo)入David 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行GO 生物過(guò)程的富集分析及KEGG通路分析，以P ≤0.01 作為篩選條件并從小到大排序。選取符合條件的GO 生物過(guò)程及KEGG 通路，并上傳至Sanger box 云平臺(tái)，進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.3 活性成分-AS 靶點(diǎn)-KEGG 通路PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從以上步驟中得到參與抗AS 的前20 條KEGG通路后，與“金銀花-玄參”活性成分、藥物及疾病共有靶點(diǎn)一起上傳至Cytoscape 3.7.0 軟件，得到“金銀花-玄參”藥物成分-藥物靶點(diǎn)-AS 靶點(diǎn)-信號(hào)通路多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，從“金銀花-玄參”藥對(duì)中獲得相關(guān)化合物283 個(gè)，經(jīng)篩選、去重共得到37 個(gè)活性成分，見(jiàn)表1（由于結(jié)果過(guò)多，只展示其中部分結(jié)果）。37 個(gè)活性化合篩選出231 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，見(jiàn)表2（由于結(jié)果過(guò)多，只展示其中部分結(jié)果）。利用Cytoscape 3.7.0 軟件進(jìn)行分析，可得到“金銀花-玄參”藥對(duì)的“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖共得到259 個(gè)節(jié)點(diǎn)，方形代表兩種中藥，菱形代表藥物活性成分，圓形代表藥物作用，見(jiàn)圖1。

圖1 “金銀花-玄參”藥對(duì)的“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

表1 “金銀花-玄參”的主要活性成分

表2 “金銀花-玄參”部分作用靶點(diǎn)基本信息

2.2 疾病靶點(diǎn)的篩選

利用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)AS 進(jìn)行檢索，經(jīng)去重后共獲得4410 個(gè)AS 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，包括載脂蛋白E、花生四烯酸5-脂氧合酶、C 反應(yīng)蛋白等。

2.3 藥物及疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化及共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

靶點(diǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化后，利用Venny 2.1 軟件繪制韋恩圖，得到藥物成分-疾病共同靶點(diǎn)173 個(gè)，主要包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子（TNF）、γ 干擾素、白細(xì)胞介素（IL）-6 等。見(jiàn)圖2。

圖2 “金銀花-玄參”藥物成分-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浼昂诵陌悬c(diǎn)的篩選

將這173 個(gè)靶蛋白基因名上傳至String 平臺(tái)，并利用Cytoscape 軟件繪制得到聯(lián)系緊密的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。不同顏色的靶標(biāo)代表藥物成分與AS 靶標(biāo)之間的密切程度，顏色越深代表聯(lián)系越密切。分析可得絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、TNF 等29 個(gè)核心靶蛋白。

圖3 “金銀花-玄參”成分抗動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 生物過(guò)程和KEGG 通路富集分析

將“2.4 項(xiàng)”核心靶蛋白基因上傳到David 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO 生物過(guò)程及KEGG 信號(hào)通路的富集分析。共得到348 個(gè)GO 條目、102 個(gè)KEGG 條目，據(jù)條件可確定49 個(gè)GO 條目，主要包括酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核質(zhì)蛋白等生物分析過(guò)程，見(jiàn)圖4。同樣篩選條件，共獲得55 條信號(hào)通路，主要包括癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎通路、胰腺癌通路等，信號(hào)通路可視化結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 “金銀花-玄參”調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶蛋白GO 生物過(guò)程可視化（前20）

圖5 “金銀花-玄參”調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶蛋白KEGG 信號(hào)通路可視化（前20）

2.6 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D構(gòu)建

將“金銀花-玄參”中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、“金銀花-玄參”藥對(duì)抗AS 關(guān)鍵靶點(diǎn)和上述可能參與到AS 疾病過(guò)程的KEGG 信號(hào)通路，利用Cytoscape軟件得到“金銀花-玄參”藥物成分-藥物靶點(diǎn)-AS 靶點(diǎn)-信號(hào)通路多維網(wǎng)絡(luò)圖，共199 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中24 個(gè)藥物成分（菱形節(jié)點(diǎn)）、20 個(gè)信號(hào)通路（三角節(jié)點(diǎn)）、155 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)（圓形節(jié)點(diǎn)），見(jiàn)圖6。

圖6 “金銀花-玄參”藥物成分-藥物靶點(diǎn)-動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

AS 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及多種發(fā)病因素，其中脂質(zhì)沉積和血管內(nèi)皮損傷是公認(rèn)的AS 發(fā)病的初始過(guò)程[20]。金銀花、玄參兩種中藥在臨床中使用廣泛，有多種重要的藥理作用，且作為四妙勇安湯的君臣藥，對(duì)AS 具有一定的治療和改善作用，但君臣藥對(duì)研究抗AS 的確切靶點(diǎn)還鮮有報(bào)道。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)資料和前期課題組實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，從微觀角度分析“金銀花-玄參”藥對(duì)活性成分及其對(duì)AS 的作用機(jī)制。

從上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可知，MAPK1、JUN、TP53、TNF 可能是“金銀花-玄參”治療AS 的核心靶點(diǎn)。MAPK1 在受到細(xì)胞應(yīng)激的刺激下被激活，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理、病理過(guò)程中起到重要作用[21]。JUN 通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和表達(dá)對(duì)減輕炎癥反應(yīng)、組織損傷等疾病具有重要意義[22]。TP53 作為重要的腫瘤抑制因子之一[23]，廣泛參與到調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程。TNF 又稱為惡液質(zhì)素，主要由巨噬細(xì)胞分泌，參與調(diào)節(jié)廣泛的生物學(xué)過(guò)程，包括脂質(zhì)代謝、凝血和細(xì)胞凋亡等[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK1、JUN、TP53、TNF 等基因主要富集于TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和Toll 樣受體信號(hào)通路。TNF 信號(hào)通路是凋亡相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路，AS 病變過(guò)程中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子及脂類介質(zhì)，與TNF-α、IL-1β 的表達(dá)呈相關(guān)性[25]。MAPK 信號(hào)通路是研究中藥抗AS 炎癥機(jī)制研究的熱點(diǎn)通路，通過(guò)抑制MAPK 信號(hào)通路的激活來(lái)抑制白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，抑制炎癥反應(yīng)[26]。Toll 樣受體參與到AS 炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)調(diào)控及斑塊形成等過(guò)程，對(duì)抗AS 發(fā)揮重要作用[27]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對(duì)“金銀花-玄參”藥對(duì)配伍抗AS 的潛在分子作用機(jī)制進(jìn)行全面的預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)“金銀花-玄參”中的槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分直接作用于MAPK1、JUN、TP53、TNF 等相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，并可能通過(guò)MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路等抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，抑制AS 的病理發(fā)展過(guò)程，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多藥物、多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同發(fā)揮作用的特點(diǎn)。本課題組也將進(jìn)一步探索“中藥多組分-生物信息學(xué)-多靶點(diǎn)多通路作用-實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證”的研究模式，為研究中藥藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制研究提供快速精準(zhǔn)的研究策略。