李曉青 李建州 楊 英 李蘭娟

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061；3.浙江大學(xué)傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310003

人工肝支持系統(tǒng)是目前臨床治療肝衰竭的最重要手段之一，而以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物人工肝（bioartificial liver，BAL）是其中的研究熱點(diǎn)[1-3]。BAL 理論上可以完全替代肝臟的合成、代謝解毒等生物學(xué)功能，國(guó)內(nèi)外已有多個(gè)BAL 系統(tǒng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但初步的研究結(jié)果并不理想，其核心問題是無法獲得足夠數(shù)量的高活性、功能良好的肝細(xì)胞[4-6]。肝細(xì)胞是BAL 的核心成分，BAL 對(duì)肝衰竭的治療作用主要取決于反應(yīng)器中的肝細(xì)胞。但肝細(xì)胞在常規(guī)的二維培養(yǎng)方式下呈平面生長(zhǎng)，不利于維持其增殖活性和生物學(xué)功能，無法滿足BAL 對(duì)細(xì)胞源的要求。而三維培養(yǎng)技術(shù)能夠?yàn)楦渭?xì)胞提供類似于肝小葉的微環(huán)境，顯著提高細(xì)胞的增殖、分化和活性，有力地彌補(bǔ)了二維培養(yǎng)的不足[7-9]。本研究擬采用海藻酸鈣微囊制備技術(shù)，構(gòu)建一套微囊流化培養(yǎng)系統(tǒng)，探討微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系及主要試劑

C3A 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；高糖DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：11995065）、胎牛血清（貨號(hào)：10099-141）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；制作微囊應(yīng)用海藻酸鈉（貨號(hào)：A2033）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；制作破囊液用檸檬酸三鈉（貨號(hào)：10019418）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FDA（貨號(hào)：F1303）、PI（貨號(hào)：P3566）熒光染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；MTT 試劑盒（貨號(hào)：11465007001）購(gòu)自瑞士Roche 公司；白蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：E80-129）購(gòu)自美國(guó)Bethyl Laboratories 公司；尿素定量試劑盒（貨號(hào)：EUR3-100）購(gòu)自美國(guó)BioAssay System 公司；Trizol 試劑（貨號(hào)：A33250）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；CYP3A4 活性定量試劑盒（貨號(hào)：V9002）、CYP1A2 活性定量試劑盒（貨號(hào)：V8752）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)：DRR036A）購(gòu)自日本TaKaRa 生物株式會(huì)社；CYP1A2（貨號(hào)：ab56073）、CYP2E1（貨號(hào)：ab53945）、CYP3A4（貨號(hào)：ab124921）、CYP3A5（貨號(hào)：ab108624）一抗抗體購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（貨號(hào)：4782S）、p-PKA（貨號(hào)：5661S）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）（貨號(hào)：2056S）、p-PKC（貨號(hào)：9371S）一抗抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）（貨號(hào)：C6974）一抗抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（貨號(hào)：BA1051）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 C3A 細(xì)胞的微囊化

置于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的C3A 細(xì)胞收獲后與海藻酸鈉溶液充分混勻，細(xì)胞密度為3×106/mL，采用層流噴射分離法制備海藻酸鈣微囊[10]：先用50 mL 注射器吸入混勻后的C3A 細(xì)胞懸液，通過導(dǎo)管連接微囊制備儀器（Nisco，LJB-5），調(diào)整機(jī)器參數(shù)使C3A 細(xì)胞懸液形成穩(wěn)定的大小均勻的海藻酸鈉液滴，滴入4℃的氯化鈣溶液中，反應(yīng)形成海藻酸鈣微囊，微囊在氯化鈣溶液中固化10 min，用4℃的生理鹽水將包裹有C3A 細(xì)胞的海藻酸鈣微囊洗滌3 遍后放置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

二維培養(yǎng)組：C3A 細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。微囊靜態(tài)培養(yǎng)組：將C3A 細(xì)胞微囊于培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)。微囊流化培養(yǎng)組：將C3A 細(xì)胞微囊置于流化床式反應(yīng)器（ZL 200710070279.0）中，與儲(chǔ)液池相連，由蠕動(dòng)泵以80 mL/min 的速度提供循環(huán)動(dòng)力，反應(yīng)器入口及出口均有篩網(wǎng)防止微囊流出，微囊在反應(yīng)器內(nèi)上下循環(huán)運(yùn)動(dòng)。3 種培養(yǎng)模式均用DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 FDA/PI 熒光雙染法檢測(cè)海藻酸鈣微囊內(nèi)C3A細(xì)胞的活性 取適量包裹C3A 細(xì)胞的微囊于24 孔板中，用PBS 洗滌后加入FDA 及PI 染料使最終濃度分別為10 μmol/L 和20 μg/mL，37℃孵育5 min，使用磷酸鹽緩沖液洗滌后于熒光顯微鏡（賽默飛，M5000）下觀察，拍照，綠色熒光標(biāo)記為活細(xì)胞，紅色熒光標(biāo)記為死細(xì)胞。

1.4.2 肝細(xì)胞合成與代謝能力檢測(cè) 將3 種模式培養(yǎng)下的C3A 細(xì)胞或細(xì)胞微囊接種于12 孔板上，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，留取上清液按試劑盒說明書分別進(jìn)行白蛋白、尿素含量的檢測(cè)。按試劑盒說明書分別進(jìn)行CYP1A2、CYP3A4 代謝活性的檢測(cè)，最終結(jié)果以培養(yǎng)孔細(xì)胞總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.3 熒光定量PCR 檢測(cè) 采用Trizol 法提取肝組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用ABI 7500 熒光定量PCR 儀（型號(hào)：QuantStudio 6）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為cDNA 4 μL、上游及下游引物各0.4 μL、定量PCR 預(yù)混液10.0 μL、超純水5.2 μL，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為50°C 2 min，95°C 10 min，95°C 30 s，60°C 30 s，40 循環(huán)，以2-△△Ct進(jìn)行分析。PCR 引物序列如下：GAPDH 上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；CYP2B6 上游引物序列為5’-TCTGGCCGGGGAAAAATCG-3’，下游引物序列為5’-GGTCACAGAGAATCGCCGAAG-3’；CYP2E1 上游引物序列為5’-GATGCCCTACATGGATGCTG-3’，下游引物序列為5’-AAATGGTGTCTCGGGTTGCT-3’；CYP3A4 上游引物序列為5’-AG-ATGCCTTTAGGTCCAATGGG-3’，下游引物序列為5’-GCTGGAGATAGCAATGTTCGT-3’；CYP1A2上游引物序列為5’-CTGGGCACTTCGACCCTTAC-3’，下游引物序列為5’-TCTCATCGCTACTCTCAGGGA-3’；UGT2B4 上游引物序列為5’-CAAATGTTGAGTTCGTTGGAGGA-3’，下游引物序列為5’-CTGACGTGTTACTGACCATCG-3’。

1.4.4 Western blot 蛋白印跡分析 取3 種培養(yǎng)模式下的C3A 細(xì)胞（細(xì)胞微囊破囊后離心收獲細(xì)胞）按常規(guī)步驟提取總蛋白、測(cè)定蛋白濃度，后進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗等步驟。用ECL 液顯色檢測(cè)蛋白信號(hào)，用BandScan圖像分析軟件分析各陽(yáng)性條帶的積分灰度值，分別計(jì)算CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、PKA、p-PKA、PKC、p-PKC、CaM 與內(nèi)參β-actin 的灰度值之比作為其蛋白相對(duì)含量值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞活性的影響

C3A 細(xì)胞微囊包裹后培養(yǎng)24 h，在倒置相差顯微鏡下觀察，微囊流化培養(yǎng)組微囊結(jié)構(gòu)完整，未見明顯破碎。熒光染色結(jié)果顯示FDA 染色呈綠色熒光，微囊內(nèi)細(xì)胞C3A 活性良好，PI 染色未見明顯紅色熒光，即未見明顯壞死細(xì)胞。見圖1。

圖1 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞活性的影響（FDA/PI 熒光雙染）

2.2 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞合成及代謝功能的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的白蛋白、尿素合成能力和CYP1A2、CYP3A4 代謝活性均高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的白蛋白、尿素合成能力及CYP1A2 代謝活性均高于微囊靜態(tài)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的CYP3A4 代謝活性與微囊靜態(tài)培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞功能的影響

2.3 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞代謝相關(guān)功能基因mRNA 表達(dá)的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的CYP1A2、CYP2B62、CYP2E1、CYP3A4、UGT2B4 基因mRNA 的表達(dá)水平均高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞CYP1A2、CYP2E1、UGT2B4 基因mRNA 的表達(dá)水平均高于微囊靜態(tài)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見圖3。

圖3 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞功能基因mRNA 表達(dá)的影響

2.4 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞代謝相關(guān)功能基因蛋白表達(dá)的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5 基因蛋白的表達(dá)水平均高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；微囊靜態(tài)培養(yǎng)組CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5基因蛋白的表達(dá)水平與微囊流化培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖4。

圖4 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞功能基因蛋白表達(dá)的影響

2.5 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞代謝相關(guān)信號(hào)通路的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞p-PKC、CaM 的表達(dá)低于二維培養(yǎng)組，PKA 蛋白的表達(dá)水平高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；微囊靜態(tài)培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞p-PKA 的表達(dá)高于二維培養(yǎng)組，微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞p-PKA 的表達(dá)低于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞p-PKC、p-PKA、CaM 的表達(dá)水平均低于微囊靜態(tài)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。三組PKC 蛋白的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖5 微囊流化培養(yǎng)對(duì)C3A 細(xì)胞代謝相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的影響

3 討論

肝細(xì)胞體外培養(yǎng)如何能長(zhǎng)時(shí)間維持其活性及生物學(xué)功能，是目前制約BAL 研究關(guān)鍵問題之一[11-12]。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式比較，BAL 所需的肝細(xì)胞的培養(yǎng)方式對(duì)于規(guī)模、時(shí)間及是否使用生物基質(zhì)等方面的要求較高，同時(shí)還需考慮到BAL 臨床應(yīng)用的實(shí)用性[13]。三維培養(yǎng)是將不同生物材料的載體與細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，能夠最大程度地模擬體內(nèi)生理環(huán)境，為解決上述問題提供了有效途徑。多種三維培養(yǎng)技術(shù)如凝膠包裹培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微重力培養(yǎng)等已被廣泛應(yīng)用到BAL 的研究中，顯著提高了肝細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模和質(zhì)量[14-20]。而微囊化培養(yǎng)與其他三維培養(yǎng)技術(shù)比較，物質(zhì)交換效率更高，培養(yǎng)密度更大且易于凍存、運(yùn)輸，在BAL 研究中具有較好的應(yīng)用前景[21-23]。

本研究采用流化床式生物反應(yīng)器，并裝載了微囊包裹的C3A 細(xì)胞，結(jié)合儲(chǔ)液池、蠕動(dòng)泵等裝置，構(gòu)建了一套三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)。研究結(jié)果顯示，包裹細(xì)胞后的海藻酸鈣微囊在24 h 的流化過程后仍能保持良好的完整性和機(jī)械強(qiáng)度，微囊內(nèi)C3A 細(xì)胞的活性與靜態(tài)培養(yǎng)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在功能評(píng)價(jià)上，與二維培養(yǎng)組比較，微囊靜態(tài)培養(yǎng)、微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的合成能力及代謝活性均顯著提高，其中微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的功能最佳，提示微囊流化培養(yǎng)是一種有效可行的三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模式。

在臨床治療上，BAL 的合成功能可以通過外源性補(bǔ)充白蛋白、血漿等來解決，代謝解毒功能才是BAL發(fā)揮作用的關(guān)鍵。CYP450 是主要分布于肝微粒體的藥物主要Ⅰ相代謝酶，參與脂肪酸、類花生四烯酸等多種內(nèi)源性物質(zhì)及藥物、毒物等外源性化合物的代謝，與肝臟的代謝解毒功能密切相關(guān)[24-25]。在本研究中，微囊化培養(yǎng)后主要的藥物代謝酶CYP1A2、CYP3A4代謝活性均明顯升高，熒光定量PCR 的檢測(cè)結(jié)果顯示CYP2B62、CYP2E1 及Ⅱ相酶UGT2B4 的表達(dá)水平同樣顯著升高，而微囊流化培養(yǎng)組相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)則更加顯著。但是在蛋白表達(dá)層面，微囊靜態(tài)培養(yǎng)與微囊流化培養(yǎng)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了探究產(chǎn)生這種差異的內(nèi)在機(jī)制，本研究對(duì)與CYP450 酶活性相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵分子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與微囊靜態(tài)培養(yǎng)組比較，微囊流化培養(yǎng)組C3A 細(xì)胞的p-PKC、p-PKA、CaM 蛋白的表達(dá)水平明顯下降，因此推測(cè)微囊流化培養(yǎng)可能通過下調(diào)PKC、PKA 的磷酸化及CaM 的水平，促進(jìn)CYP450 酶活性的增強(qiáng)，但是其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，微囊流化培養(yǎng)能夠顯著提高C3A 細(xì)胞的合成及代謝能力，為BAL 提供高活性、功能良好的種子細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與下調(diào)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的磷酸化及CaM 的水平有關(guān)。