王廣超，劉麗駿，蔣偉文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜病科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海（200011）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的惡性腫瘤之一，吸煙和酗酒是OS?CC的主要病因［1］?？谇话装撸╫ral leukoplakia，OLK）是口腔黏膜上以白色斑塊或斑片為主的損害，不能定義為其它任何疾病，是最常見的口腔癌前病損。OLK惡變的最可預(yù)測因素是活檢中存在異型增生，研究表明異型增生患者的惡性風(fēng)險為31.4%～36.3%［2］。因此，明確OLK和OSCC的生物學(xué)關(guān)系，對于預(yù)防OLK癌變和OSCC的早期診斷有重要意義。

除基因組突變外，表觀遺傳學(xué)改變已被確定為OSCC的重要特征［3］，尤其是轉(zhuǎn)錄起始位點啟動子附近發(fā)生的DNA甲基化，通常會造成基因表達(dá)沉默和信號通路失調(diào)［4］。而且，在許多癌癥中，通過啟動子DNA甲基化導(dǎo)致的抑癌基因失活甚至比體細(xì)胞突變更加頻繁［5］。DNA甲基化可能推動腫瘤發(fā)生和惡性進展。本文探討DNA甲基化修飾在口腔白斑癌變中的作用，為揭示DNA甲基化在癌前病變和腫瘤發(fā)病過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 收集樣本和Illumina 450K甲基化芯片檢測

在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科和口腔黏膜病科就診患者中收集40例OSCC組織樣本、28例OLK組織樣本和40例正常健康口腔黏膜組織樣本。其中，40位捐贈OSCC組織樣本的患者來自口腔頜面外科，口腔黏膜病史不詳。本研究已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理審查委員會的批準(zhǔn)，并獲得了患者的知情同意。使用Illumina 450K甲基化芯片（博奧生物，北京）檢測上述樣本，得到DNA甲基化位點的β值數(shù)據(jù)［6］。

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫中表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理

檢索GEO（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，得到OSCC、OLK以及正?？谇火つそM織的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)實驗需求選用GSE33205［7］和GSE85195［8］兩個表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。

1.3 DNA甲基化譜和表達(dá)譜數(shù)據(jù)特點統(tǒng)計分析

在R語言平臺上，分別在40例OSCC組織樣本、28例OLK組織樣本以及40例健康口腔黏膜組織樣本中隨機選取1例OSCC、1例OLK和1例健康口腔黏膜樣本，選取DNA甲基化β值最少的5%位點。計算這些位點在上述3例不同樣本之間的重疊率。重復(fù)上述過程10次，得到不同類別樣本的平均重疊率。分別在40例OSCC組織樣本、28例OLK組織樣本以及40例健康口腔黏膜組織樣本中隨機選擇2例相同類別的樣本，重復(fù)上述過程10次，得到相同類別樣本的平均重疊率。下載GSE85195數(shù)據(jù)集，分別隨機選取1例OSCC樣本，1例OLK樣本以及另外1例健康口腔黏膜樣本，得到表達(dá)值位于95%以上的探針I(yè)D。計算這些探針I(yè)D在不同樣本之間的重疊率。重復(fù)上述過程10次，得到不同類別樣本的平均重疊率。在GSE85195數(shù)據(jù)集中隨機選取2例OSCC，2例OLK，在GSE33205數(shù)據(jù)集中隨機選擇2例健康口腔黏膜樣本，得到表達(dá)值位于95%以上的探針I(yè)D，計算這些探針在相同類別樣本中的重疊率。重復(fù)上述過程10次，得到相同類別樣本的平均重疊率。

1.4 篩選OSCC和OLK差異DNA甲基化位點并整理相應(yīng)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)

在R語言平臺上，所有樣本的β值轉(zhuǎn)換為M值［9］。分別計算OSCC、OLK和健康口腔黏膜每個位點的平均M值。選取OSCCvs.Normal平均值相差大于1.4的位點，以及OLKvs.Normal平均值相差大于1.4的位點。加載Limma包，對上述位點進行差異分析［10］。選取P＜0.01且校正后P＜0.05的位點。整理后得到OSCC差異甲基化位點和OLK差異甲基化位點。下載GSE85195的數(shù)據(jù)集，提取OSCC和OLK差異甲基化位點所在基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。計算OSCC和OLK每一個探針的平均表達(dá)強度，輸出整理后的表格供后續(xù)分析使用。

1.5 生物學(xué)通路分析

在IPA生物學(xué)通路（Ingenuity Pathway Analysis）平臺（QIAGEN，德國）上，提交OSCC和OLK差異甲基化位點相關(guān)基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。分別進行核心分析和對比分析。得到分析報告后，分別下載經(jīng)典通路的富集結(jié)果以及顯著富集的網(wǎng)絡(luò)。在對比分析中下載共同富集的通路。

2結(jié)果

2.1 DNA甲基化譜相對表達(dá)譜數(shù)據(jù)具有更多的差異性

本實驗共獲得48 5203個DNA甲基化位點在28例OLK，40例OSCC和40例健康口腔黏膜樣本中的β值數(shù)據(jù)（圖1）。GSE33205數(shù)據(jù)集中含有50例HNSCC和25例健康口腔黏膜樣本。GSE85195數(shù)據(jù)集中含有15例OLK和34例OSCC和1例健康口腔黏膜樣本（表1）。在各樣本兩兩比較中，DNA甲基化譜的數(shù)據(jù)在貝塔值最小的5%重疊率為61%～67%，而表達(dá)譜數(shù)據(jù)在表達(dá)量最多的5%重疊率為75%～83%（表2、表3）。

表1 本次實驗選用的外部表達(dá)譜數(shù)據(jù)集Table 1 External expression profile data set selected for this experiment

表2 DNA甲基化譜在β值最小時的5%重疊率Table 2 5%overlap of DNA methylation spectrum at the lowestβvalue

表3 表達(dá)譜在表達(dá)量最大時的5%重疊率Table 3 The 5%overlap rate of the expression profile at the maximum expression level

2.2 差異DNA甲基化位點和表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理結(jié)果

Figure 1 Heatmap of partial detection of Illumina 450K meth?ylation chip圖1 Illumina 450K甲基化芯片部分檢測熱圖

本實驗在28例OLK和40例健康口腔黏膜DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)比對中得到4 396個OLK差異DNA甲基化位點。在40例OSCC和40例健康口腔黏膜DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)比對中得到3 475個OSCC差異DNA甲基化位點。其中，OLK差異DNA甲基化位點中有671個DNA甲基化位點在OLK組織中上調(diào)，有3 725個DNA甲基化位點在OLK組織中下調(diào)。另外，在OSCC差異DNA甲基化位點中有2 768個DNA甲基化位點在OSCC組織中上調(diào)，有707個DNA甲基化位點在OSCC組織中下調(diào)。OLK和OSCC差異DNA甲基化位點相交423個。4 396個OLK差異DNA甲基化位點經(jīng)注釋得到1 809個對應(yīng)基因。3 475個OSCC差異DAN甲基化位點經(jīng)注釋得到1 457個對應(yīng)基因。其中，這兩者相交338個基因。提取GSE85195數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，1 809個OLK差異DNA甲基化位點相關(guān)基因位于表達(dá)譜芯片中的2 862個探針上，其中1 805個探針在OLK表達(dá)譜數(shù)據(jù)中顯示上調(diào)，1 057個探針在OLK表達(dá)譜數(shù)據(jù)中顯示下調(diào)。1 457個OSCC差異DNA甲基化位點相關(guān)基因位于表達(dá)譜芯片中的2 198個探針上，其中1 117個探針在OSCC表達(dá)譜數(shù)據(jù)中顯示上調(diào)，1 081個探針在OSCC表達(dá)譜數(shù)據(jù)中顯示下調(diào)。

2.3 OLK差異DNA甲基化相關(guān)基因主要參與細(xì)胞運動和分化

OLK差異DNA甲基化相關(guān)基因的IPA生物學(xué)通路和網(wǎng)絡(luò)分析表明，在OLK組織中，細(xì)胞骨架的組織、多種發(fā)育過程、結(jié)締組織分化和細(xì)胞運動等過程處于活躍狀態(tài)。其中Sp3轉(zhuǎn)錄因子（Sp3 tran?scription factor，SP3）、Sp4轉(zhuǎn)錄因子（Sp4 transcrip?tion factor，SP4）、淋巴增強因子1（lymphoid enhanc?er binding factor 1，LEF1）、KLF4（Kruppel like factor 4）、早期B淋巴細(xì)胞因子（early B?cell factor 2，EBF2）、GATA結(jié)合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）、GLI1（GLIfamily zinc finger 1，GLI1）活化，激活RNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。細(xì)胞粘附分子SDCBP（syn?decan binding protein，SDCBP）、CTNNB1（catenin be?ta 1，CTNNB1）活化促進細(xì)胞運動和分化。肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、成纖維細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）和胰島素樣生長因子1受體（insulin?like growth factor 1 recep?tor，IGF1R）以及絲裂原活化激酶?7（mitogen?activat?ed protein kinase，MAPK7）活化增強細(xì)胞存活抗凋亡。同時，染色質(zhì)修飾蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶5B（lysine demethylase 5B，KDM5B）抑制，賴氨酸乙 酰 轉(zhuǎn) 移 酶6A（lysine acetyltransferase 6A，KAT6A）、SWI/SNF相關(guān)，基質(zhì)關(guān)聯(lián)，肌動蛋白依賴染色質(zhì)調(diào)控因子，亞家族a，成員4（SWI/SNF relat?ed，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily a，member 4，SMARCA4）活化使得組蛋白和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)得到相應(yīng)修飾。含鈣離子依賴性C2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)5（C2 calcium depen?dent domain containing 5，C2CD5）活化促進葡萄糖轉(zhuǎn)運（圖2）。

2.4 OSCC差異DNA甲基化相關(guān)基因參與細(xì)胞癌變的多個過程

在IPA生物學(xué)通路分析平臺上，得到OSCC差異甲基化相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)富集結(jié)果，富集評分大于或等于40的網(wǎng)絡(luò)共有3個。網(wǎng)絡(luò)1相關(guān)基因主要富集在細(xì)胞運動，遷移，分化等生物學(xué)過程和通路。網(wǎng)絡(luò)2相關(guān)基因主要富集在發(fā)育，氧化調(diào)節(jié)、蛋白折疊、抗凋亡等生物學(xué)過程和通路。網(wǎng)絡(luò)3相關(guān)基因主要富集在離子轉(zhuǎn)運，細(xì)胞遷移，細(xì)胞周期等生物學(xué)過程和通路。為了方便展示，把這三個網(wǎng)絡(luò)合并為一個網(wǎng)絡(luò)（圖3）。其中，視黃醇脫氫酶（dehydrogenase/reductase 3，DHRS3）、谷胱甘肽過氧化物酶3（glutathione peroxi?dase 3，GPX3）、細(xì)胞色素P450家族成員CYP26A1（cytochrome P450 family 26 subfamily A member 1，CYP26A1）以及多種氧化損傷保護蛋白下調(diào)，從而增加細(xì)胞氧化損傷，進一步加重蛋白折疊錯誤率。在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endotheli?al growth factor，VEGF）的作用下，多種同型盒基因表達(dá)改變促進細(xì)胞增殖和分化。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信號通路活化促使肌鈣蛋白和錨定蛋白激活，進而重組細(xì)胞骨架。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering re?ceptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）活化觸發(fā)組成型炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生形成慢性炎癥，伽馬分泌酶（Secretaseγ）增多使線粒體功能失調(diào)，鉀通道四聚化結(jié)構(gòu)域?2（potassium channel tetramer?ization domain containing 2，KCTD2）、氯離子通道Tweety家族蛋白成員TTYH1（Tweety family mem?ber 1）、鈣離子通道蘭尼定受體1（ryanodine recep?tor 1，RYR1）以及鈉離子和碳酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白SLC4A7（solute carrier family 4 member 7）的表達(dá)也受到影響，這些改變共同促進細(xì)胞增殖，遷移和染色質(zhì)重塑。

2.5 OSCC和OLK差異DNA甲基化位點相關(guān)基因共同富集在磷酸肌醇代謝過程

在IPA生物學(xué)通路分析平臺上，對比分析結(jié)果表明，OSCC和OLK差異甲基化位點相關(guān)基因在多種磷酸肌醇生物合成和代謝以及磷脂酶C信號通路富集（表4）。其中肌醇磷酸生物合成，3?磷酸肌醇生物合成，肌醇四磷酸磷酸酯生物合成以及5?磷酸肌醇代謝在OLK和OSCC中均處于活化狀態(tài)。磷脂酶C信號通路在OSCC中抑制，在OLK中活化。

Figure 2 The genes associated with OLK differential DNA methylation sites are mainly involved in cell movement and differentiation圖2 口腔白斑差異DNA甲基化位點相關(guān)基因主要參與細(xì)胞運動和分化

Figure 3 OSCC differential DNA meth?ylation related gene enrichment network圖3 口腔鱗狀細(xì)胞癌差異DNA甲基化相關(guān)基因富集網(wǎng)絡(luò)

表4 口腔鱗狀細(xì)胞癌與口腔白斑差異DNA甲基化位點相關(guān)基因顯著富集的前6個通路Table 4 The first six pathways with significant enrichment of genes related to different methylation sites of OSCCand OLK

3討論

為了驗證在腫瘤形成過程中DNA甲基化是否具有不同程度的改變，本實驗選用DNA甲基化程度最低的位點進行重復(fù)比對分析。低表達(dá)的mRNA在實驗過程中不穩(wěn)定，并且在檢測過程中容易受系統(tǒng)誤差干擾，因此表達(dá)譜對比部分，本實驗選用表達(dá)量最高的5%進行分析。研究表明，DNA甲基化修飾具有靈活變化的特點，表達(dá)譜相對穩(wěn)定。由于基因表達(dá)受到多種表觀因素的影響，表觀遺傳的可塑性使得細(xì)胞可以通過啟動新的轉(zhuǎn)錄程序增加調(diào)節(jié)潛力，從而改變細(xì)胞的可延展方式［11］。這意味著表觀系統(tǒng)具有更早的接受外部信息的能力，可以被應(yīng)用于腫瘤形成的早期診斷。

腫瘤發(fā)生和進展是涉及多層次、多過程、多通路的復(fù)雜過程。研究表明，腫瘤的發(fā)生伴隨著多個基因突變以及染色體結(jié)構(gòu)異常，從而促使細(xì)胞進入惡性增殖過程［12］。DNA甲基化是重要的染色質(zhì)修飾手段。DNA通過甲基化修飾，可以沉默或激活相關(guān)基因，改變?nèi)旧w折疊狀態(tài)，進而促進機體發(fā)育和細(xì)胞分化［13］。目前已有大量研究表明，DNA甲基化修飾的改變在OSCC發(fā)病過程中有重要作用，尤其是抑癌基因啟動子區(qū)域高甲基化失活可能成為細(xì)胞癌變的關(guān)鍵步驟［3，14］。本研究差異DNA甲基化結(jié)果證實，不僅僅在腫瘤發(fā)生階段，甚至在癌前病變中，就已經(jīng)存在較多DNA甲基化的改變。研究表明，在癌前狀態(tài)下，由于外部不良刺激以及局部炎癥壓力，促使細(xì)胞骨架重組和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變［15］。在這個過程中染色質(zhì)也會有相應(yīng)的重塑，而DNA甲基化修飾是重要的調(diào)節(jié)方式［16］。

在腫瘤發(fā)生早期，由于內(nèi)外壓力共同作用，細(xì)胞會有一定時間的呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生過量的反應(yīng)性活性氧。這些活性氧產(chǎn)物會通過各種途徑導(dǎo)致線粒體呼吸鏈損傷以及DNA突變。維持DNA的高保真性是一個高耗能的過程。為了維持DNA穩(wěn)定，在線粒體功能不足的情況下，那些選擇無氧糖酵解的細(xì)胞有更大的可能性從凋亡的命運中逃離出來。在OSCC生物學(xué)通路分析中，伴隨DNA甲基化改變，多個抗氧化保護蛋白下調(diào)。它們有的定位于線粒體，有的定位于細(xì)胞質(zhì)。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，HNSCC中的泛醌還原酶亞基A13處于高甲基化低表達(dá)狀態(tài)［17］。與此類似，本研究OSCC表達(dá)譜結(jié)果證實泛醌還原酶亞基A1在OSCC中同樣處于低表達(dá)狀態(tài)。有趣的是，泛醌還原酶亞基A1在OLK中處于低甲基化高表達(dá)狀態(tài)。泛醌還原酶位于線粒體內(nèi)膜，是有氧氧化呼吸鏈的重要蛋白。以上研究結(jié)果反映OSCC發(fā)生過程中可能存在有氧呼吸增強而后弱化的過程，這為抗氧化藥物預(yù)防OLK癌變提供了依據(jù)。

多個離子通道和轉(zhuǎn)運分子活化結(jié)果表明OSCC進展過程中伴隨頻繁的離子內(nèi)外交換，可能參與多個癌變過程。同以往研究結(jié)果一致，在OSCC和OLK組織中，鈣通道蛋白蘭尼定受體2（ryanodine receptor 2，RYR2）處于高甲基化低表達(dá)狀態(tài)［18］。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)OSCC和OLK組織中的RYR1處于低甲基化高表達(dá)狀態(tài)。鈣離子信號在分化和組織動態(tài)平衡中具有重要作用。由于體細(xì)胞突變或表觀遺傳沉默引起的鈣離子信號變化改變會削弱分化，與其它致癌因素相結(jié)合，可能加速促進口腔黏膜細(xì)胞癌變的進程。

炎細(xì)胞浸潤和免疫反應(yīng)是細(xì)胞癌變的常見現(xiàn)象。持續(xù)的炎性環(huán)境產(chǎn)生了大量的活性氧簇，促使炎細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等炎性介質(zhì)，其引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。

中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化后將產(chǎn)生大量反應(yīng)性活性氧和反應(yīng)性活性氮等氧化物。它們可促進增殖細(xì)胞發(fā)生DNA損傷、癌基因激活及抑癌基因失活。反復(fù)的慢性炎癥刺激還將通過各種信號通路募集免疫抑制性細(xì)胞，這些細(xì)胞激活后能抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能，促進突變細(xì)胞免疫逃逸。在炎癥反應(yīng)中，磷酸肌醇代謝參與多種炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［19］。本研究證實，從癌前狀態(tài)的OLK到腫瘤形成的OSCC均伴隨磷酸肌醇代謝活動的增強，這提示了DNA甲基化狀態(tài)改變導(dǎo)致磷酸肌醇代謝活動增強可能是OSCC發(fā)生發(fā)展的重要誘因；磷酸肌醇代謝以及磷脂酶C相關(guān)基因表達(dá)和DNA甲基化檢測可能成為OSCC風(fēng)險評估的重要因素。

【Author contributions】Wang GC collected，processed and ana?lyzed the data and wrote the article.Liu LJ processed the research.Ji?ang WW designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.