張凱，劉小元，李蕾，李君，韓祥禎，何惠宇

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）口腔修復(fù)科·新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊（830054）

骨組織工程是目前的研究熱點，三維打印（3D print）能夠逐層構(gòu)建具有復(fù)雜形狀和幾何形狀的功能部件［1］。基于不同的工作原理可以加工各種材料，包括聚合物、陶瓷、金屬和復(fù)合材料，制備出具有定制的形狀和致密的宏觀/微觀多孔結(jié)構(gòu)，將3D打印技術(shù)與骨組織工程相結(jié)合，可以制備出與缺損組織大小相適應(yīng)的組織工程骨支架。

鹿茸是一種珍貴的中藥原料，其磷酸鈣成分與人體骨骼中的磷酸鈣含量相似。Li等［2］發(fā)現(xiàn)鹿茸Ⅰ型膠原對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有生物修復(fù)的作用，可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖分化。絲素蛋白具有低免疫原性、無細(xì)胞毒性、加工性能好、抗拉強(qiáng)度強(qiáng)等特點，近年來也成為了組織工程骨常用的支架材料。聚乙烯醇作為一種具有良好的機(jī)械性能與熱穩(wěn)定性的高分子水溶性材料，因其同時還具有一定的粘接性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［3］。以聚乙烯醇為基質(zhì)，將鹿角粉與絲素蛋白結(jié)合構(gòu)建的新型組織工程骨具有極大的研究意義及潛在的臨床價值。

細(xì)胞膜片技術(shù)是指在體外連續(xù)培養(yǎng)高密度接種的細(xì)胞，使其形成一張由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的膜片。Ueha等［4］發(fā)現(xiàn)磷酸三鈣/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/成骨誘導(dǎo)細(xì)胞膜片復(fù)合物有較強(qiáng)的成骨能力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，馬鹿角粉/絲素蛋白/聚乙烯醇支架被證明在大鼠體內(nèi)具有良好的生物相容性與促進(jìn)骨再生的能力，本實驗擬探討細(xì)胞膜片結(jié)合馬鹿角粉/絲素蛋白/聚乙烯醇支架在極限性下頜骨骨缺損中的成骨效應(yīng)及支架自身的降解情況，為骨組織工程提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗選取體質(zhì)量（32±3）kg的12月齡阿勒泰大尾羊12只（雌雄不限）用于制備下頜骨極限性缺損動物模型，體質(zhì)量（9±1.5）kg的6月齡阿勒泰大尾羊2只（雌雄不限）用于抽取骨髓培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（實驗動物合格證號:SYXK（新）2018?0003）。本實驗已通過新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的審查和批準(zhǔn)（倫理審批號:IACUC20170706?04）。

1.2 實驗材料與設(shè)備

馬鹿角粉（特豐藥業(yè)股份有限公司，中國）；粒徑20 nm納米級羥基磷灰石（埃普瑞納米材料公司，中國）；蠶繭（Fisherbrand，美國）；聚乙烯醇（分析純）；電子天平（Sartorius BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器公司，中國）；3D打印機(jī)（Projet 460Plus，建寧龍達(dá)，中國）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heal Froce，中國）；離心機(jī)（Eppendorf，德國）；倒置相差顯微鏡及拍照系統(tǒng)（Leica，德國）；脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，中國）；超凈臺（蘇潔醫(yī)療器械有限公司，中國）；掃描電子顯微鏡（JEOL?JSM?6390LV，JEOL，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 3D打印兩種支架 將蠶繭殼剪碎，經(jīng)過煮沸和脫膠處理，透析48 h，離心后取上清液，即為絲素蛋白液。將聚乙烯醇粉末加入超純水煮沸1 h并不斷攪拌至溶液透明，待其冷卻后制得聚乙烯醇凝膠。根據(jù)前期實驗結(jié)果，將絲素蛋白液與聚乙烯醇凝膠以體積比為1∶4的比例進(jìn)行混合配成混合液，分別將馬鹿角粉與羥基磷灰石粉以1 g:1.3 mL混合液及1 g:1.7 mL混合液裝入3D打印機(jī)內(nèi)，按照課題組前期研究［5］的羊極限骨缺損大小打印出馬鹿角粉/絲素蛋白/聚乙烯醇支架及納米級羥基磷灰石/絲素蛋白/聚乙烯醇支架，具體參數(shù)為:20 mm×5 mm×3 mm，見圖1。

Figure 1 3D?printed antler powder/silk fibroin/poly?vinyl alcohol scaffolds and nanohydroxyapatite/silk fi?broin/polyvinyl alcohol scaffolds圖1 3D打印馬鹿角粉/絲素蛋白/聚乙烯醇支架及納米級羥基磷灰石/絲素蛋白/聚乙烯醇支架

1.3.2 細(xì)胞膜片的培養(yǎng) 將6月齡阿勒泰大尾羊麻醉后，于髂骨平臺處行骨穿刺抽取約10 mL骨髓血，采用全骨髓培養(yǎng)法，將過濾后的骨髓血均勻分配至3～4個細(xì)胞瓶內(nèi)，向每個細(xì)胞瓶中加入5 mL DMEM培養(yǎng)基，直至細(xì)胞增殖鋪滿整個細(xì)胞瓶底后傳代，將第三代細(xì)胞轉(zhuǎn)移至60 mm2培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)皿后加入成膜誘導(dǎo)液，連續(xù)誘導(dǎo)10 d，鏡下可見培養(yǎng)皿邊緣細(xì)胞膜部分卷起折疊，可用顯微鑷揭起，同時具有一定的韌性及厚度，即為培養(yǎng)成功。見圖2。

Figure 2 The morphology of the cell sheet圖2 細(xì)胞膜片形態(tài)

1.3.3 細(xì)胞膜片包裹支架 支架回植前，先將支架進(jìn)行高溫高壓消毒，置于6孔板內(nèi)，加入含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中浸泡，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將已消毒的支架放于細(xì)胞膜中央，用鑷子輕柔將細(xì)胞膜片邊緣揭起小心包裹支架，構(gòu)成細(xì)胞膜?支架復(fù)合物，再加入適量培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中備用。

1.3.4 實驗動物頜骨缺損模型制備、回植及取材 選取體質(zhì)量（32±3）kg的12月齡阿勒泰大尾羊12只（雌雄不限），按觀察時間1、2、3個月分別建立阿勒泰大尾羊雙側(cè)下頜骨極限性缺損模型4只，實驗組為細(xì)胞膜片包裹馬鹿角粉/絲素蛋白/聚乙烯醇支架，對照組為細(xì)胞膜片包裹納米級羥基磷灰石/絲素蛋白/聚乙烯醇支架，陰性對照組為細(xì)胞膜片包裹無支架的凝膠海綿；按動物雙側(cè)下頜骨缺損區(qū)自身對照的方法分別植入包裹細(xì)胞膜的支架或包裹細(xì)胞膜的膠海綿。2只羊一側(cè)植入實驗組支架材料，對側(cè)為陰性對照組，另外2只羊一側(cè)植入對照組支架材料，對側(cè)為陰性對照組。在全麻下，進(jìn)行術(shù)區(qū)備皮，碘伏進(jìn)行口內(nèi)外擴(kuò)大消毒，充分暴露其下頜骨外側(cè)面，使用龍膽紫標(biāo)記切口范圍（圖3a），順皮膚紋理按標(biāo)記切開（圖3b），止血鉗緩慢鈍性逐層分離直至暴露骨面（圖3c），使用繃帶固定下頜骨后使用慢速手機(jī)在設(shè)計好的區(qū)域制備一20 mm×5 mm×3 mm骨缺損（圖3d）；分別放置各實驗組的支架（圖3e），分層對位縫合筋膜層、肌層及皮膚層關(guān)閉創(chuàng)面（圖3f）。術(shù)后隔日觀察術(shù)后恢復(fù)情況，連續(xù)3 d肌注青霉素預(yù)防感染。分別于術(shù)后1、2、3個月處死實驗動物，收集樣本，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要觀察指標(biāo)

1.4.1 掃描電鏡觀察 將兩組支架各取5塊樣品，使用掃描電鏡對支架材料的孔徑及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察；同時在每個相同倍數(shù)視野下選擇樣品不同表面的不同部分采集圖像，使用Photoshop軟件分析每張掃描電鏡圖像，使用直方圖（histogram）的計算功能，分別記錄每個樣品每張圖片表面孔隙所占象素數(shù)p（pixel）及樣品表面所占總體象素數(shù)P，采用公式＝p/P×100%，選取不同區(qū)域的視野，經(jīng)過多次計算統(tǒng)計，取平均值，即可得到該支架的孔隙率值。

1.4.2 影像學(xué)檢查 采用錐束形CT（CBCT）對骨缺損區(qū)進(jìn)行定性分析，對實驗動物實施安樂死后，用保鮮膜將其完整下頜骨包裹好進(jìn)行CBCT的掃描，截取實驗制備的骨缺損區(qū)矢狀面下頜骨下緣至牙槽骨最寬處的影像圖來定性分析骨缺損處的修復(fù)情況；同時對每個樣本缺損中心處的骨密度值（bone mineral density，BMD）進(jìn)行定量分析。

1.4.3 組織學(xué)觀察 去凈樣本術(shù)區(qū)軟組織后，在術(shù)區(qū)范圍內(nèi)取約0.5 cm厚度的組織塊標(biāo)本，經(jīng)過10%甲醛溶液固定和15%EDTA溶液脫鈣后，包埋切片進(jìn)行蘇木精?伊紅染色，觀察術(shù)區(qū)骨修復(fù)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在孔徑及孔隙率檢測中，采用獨(dú)立樣本t檢驗，在骨密度對比采用3×3析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察

掃描電鏡結(jié)果可見兩組支架材料空隙近似正方形，較為規(guī)則，大小較為一致，連續(xù)性好，層與層之間連接良好，見圖4。實驗組支架孔徑為（345±42）μm，對照組支架孔徑為（330±58）μm，兩組間孔徑比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.105）；實驗組支架孔隙率為（34.35±4.6）%，對照組支架孔隙率為（32.75±5.2）%，兩組間孔隙率比較無明顯差異（P＝0.115）。

2.2 影像學(xué)觀察

CBCT結(jié)果可見:各組在術(shù)后1個月末，均未見明顯支架材料與骨組織愈合，實驗組與對照組可缺損區(qū)骨密度低于周圍正常骨組織，但支架材料與缺損處的間隙較為模糊，陰性對照組骨缺損區(qū)界限較為明顯；在術(shù)后2個月末，實驗組與對照組缺損區(qū)骨密度高于術(shù)后1個月末，骨皮質(zhì)連續(xù)骨髓腔也有部分聯(lián)通，類骨質(zhì)初步形成；在術(shù)后3個月末，實驗組缺損區(qū)已無明顯低密度投射區(qū)，骨密度維持在接近正常骨密度的水平，骨缺損基本被修復(fù)，對照組缺損區(qū)低密度投射區(qū)范圍較第2個月時縮小明顯，骨缺損大部分被修復(fù)，陰性對照組缺損處透射區(qū)范圍較第1個月末時縮小，但仍可見明顯的低密度投射區(qū)，骨皮質(zhì)不連續(xù)，骨缺損大部分未愈合。見圖5。

Figure 5 CBCT scan in the sagittal plane in each group after the operation圖5 各組術(shù)后CBCT掃描矢狀面

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)時間與材料兩因素?zé)o交互效應(yīng)，故各組隨機(jī)選擇3個支架中央?yún)^(qū)域的骨密度值單因素方差分析，結(jié)果顯示，在術(shù)后的各時間點實驗組的骨缺損區(qū)中央密度計量均高于對照組、陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 支架植入后不同時間骨缺損區(qū)中央骨密度計量學(xué)分析Table 1 Quantitative analysis of central bone mineral density in bone defect area at different time after stent implantation

2.3 HE染色組織學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示:在術(shù)后1個月，實驗組植入?yún)^(qū)可見少量成骨細(xì)胞，材料周圍較多破骨樣細(xì)胞及纖維結(jié)締組織；術(shù)后2個月，與對照組相比，實驗組成骨細(xì)胞較為活躍，有較多新生毛細(xì)血管及骨小梁形成；術(shù)后3個月，與對照組相比，實驗組的支架材料大部分已經(jīng)被吸收，可見骨小梁排列規(guī)則及成熟板狀骨，對照組也有新骨形成；但術(shù)后各時 間點，陰性對照組均未見明顯變化。見圖6。

Figure 6 Observation results of HEstaining in each group after operation圖6 各組術(shù)后HE染色觀察結(jié)果

3討論

近年來，組織工程中支架材料本身性能已經(jīng)成為研究熱點，而種子細(xì)胞作為組織工程的另一要素之一，對骨缺損的最終修復(fù)效果也有重要影響［6］。種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合來修復(fù)骨缺損在組織工程領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用，當(dāng)種子細(xì)胞誘導(dǎo)成膜后，其膜片保留了完整的細(xì)胞外基質(zhì)，能保證膜片與宿主組織或病變組織緊密黏附，有利于細(xì)胞間的物質(zhì)交換，減少細(xì)胞丟失［7］，為支架材料周圍的骨再生提供了一個兼有細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及生物活性分子的微環(huán)境，從而促進(jìn)了支架材料的骨結(jié)合。

鹿茸是一種珍貴的中藥原料，它的一個重要生物學(xué)特性是生長迅速，主要與軟骨、骨、表皮和其他組織生長相關(guān)的各種生長因子被大量表達(dá)或顯示出增強(qiáng)的生物活性有關(guān)，同時其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物也為骨組織的修復(fù)提供原料［8］，其臨床效果觀察已經(jīng)表明，鹿角粉制劑具有增強(qiáng)骨骼和肌肉，促進(jìn)血液流動，增加免疫功能等作用。動物藥材的有效成分主要在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間質(zhì)，且以胞內(nèi)為主［9］。超微粉碎在完全破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可增大動物藥材表面積比及孔隙率，增加水溶性蛋白含量溶出度，增大溶出速率［10］，利于有效成分吸收，因此其粉劑更適用于組織工程支架材料的制作與加工。

羥基磷灰石作為人體骨骼的主要成分，是最常用的組織工程骨支架材料之一［11］，但由于自身降解性能較差，常與其他材料復(fù)合制作組織工程骨支架；由于頜骨需要承擔(dān)部分咬合力，需要支架材料具有一定的力學(xué)性能，而絲素蛋白具有良好的降解性能，但本身力學(xué)性能欠佳［12］；將馬鹿角粉和羥基磷灰石粉以適當(dāng)?shù)谋壤旌?，可以克服各自材料的缺陷，制備出兼具良好力學(xué)性能和合適降解性能的組織工程骨支架。本實驗將納米級羥基磷灰石/絲素蛋白/聚乙烯醇作為對照組，同時因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片具有一定成骨作用，本實驗主要針對兩種支架材料的性能進(jìn)行研究。細(xì)胞膜片單獨(dú)從培養(yǎng)皿中取出會皺縮呈團(tuán)，為排除干擾，故選擇用細(xì)胞膜片包裹凝膠海綿作為陰性對照組。

掃描電鏡結(jié)果可以看出，雖然在孔徑及孔隙率方面兩組支架材料并無明顯差異，已有研究證實，當(dāng)最小孔徑為100～150μm時，就可滿足組織再生的需求，并且認(rèn)為支架材料的孔徑在300～600μm間，最有利于新骨長成；當(dāng)孔隙率超過30%，材料孔隙之間相互連通，新生組織可長入孔內(nèi)，相互聯(lián)通結(jié)合，形成新骨，且孔隙率越高，越有利于成骨細(xì)胞在支架表面的黏附［13］。但是可以看出實驗組支架材料表面更為粗糙，與細(xì)胞膜片的接觸面積更大，更加有利于細(xì)胞的攀附，加快細(xì)胞代謝的同時也更有利于自身的降解。

由于骨缺損的愈合方式是由缺損邊緣向中心愈合［14］，影像學(xué)結(jié)果表明經(jīng)過3個月，缺損中心處骨密度已接近正常骨組織，說明當(dāng)有合適組織工程骨存在時，極限骨缺損是可以被基本修復(fù)的。在術(shù)后2個月末時，實驗組支架材料，成骨速度與質(zhì)量已經(jīng)明顯優(yōu)于對照組，同時實驗組支架降解速率與促進(jìn)成骨速率較為匹配，支架降解完成的同時，骨缺損的修復(fù)也基本完成。

在術(shù)后2個月，HE染色結(jié)果實驗組可見缺損區(qū)與支架空隙周圍發(fā)現(xiàn)大量破骨細(xì)胞、成軟骨樣結(jié)構(gòu)及成骨樣細(xì)胞出現(xiàn)，支架與骨的骨質(zhì)界限可見，但支架形態(tài)不規(guī)則表示其開始降解；在術(shù)后3個月，實驗組可見有大量纖維血管化、成軟骨樣結(jié)構(gòu)及成骨樣細(xì)胞出現(xiàn)在手術(shù)結(jié)合區(qū)及支架空隙周圍，并且結(jié)合區(qū)可見骨小梁樣結(jié)構(gòu)，支架與骨質(zhì)結(jié)合線模糊，可見骨質(zhì)生長入支架材料。由此可見破骨細(xì)胞在骨改建過程中，對支架材料無機(jī)部分的降解有一定促進(jìn)作用。同時，支架材料作為異物植入體內(nèi)，必然會引發(fā)機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)，鹿角粉有機(jī)基質(zhì)中Ⅰ型膠原含量達(dá)80%～90%，研究表明，巨噬細(xì)胞可通過與Ⅰ型膠原的相互作用而分泌基質(zhì)金屬蛋白酶以促進(jìn)膠原降解，從而影響支架材料的降解速率［15］。

綜上所述，由細(xì)胞膜片包裹3D打印的馬鹿角粉/絲素蛋白/聚乙烯醇支架構(gòu)成的組織工程骨，可基本修復(fù)缺損骨組織，同時自身大部分也可被吸收，體現(xiàn)出良好的成骨能力與可降解性能，是具有良好發(fā)展前景的組織工程骨的支架材料。

【Author contributions】Zhang K performed the experiments and wrote the article.Liu XY，Li L，Li Jand Han XZ collected，processed and analyzed the data.He HY designed the study and reviewed the arti?cle.All authors read and approved the final manuscript as submitted.