黃偉，譚順玲，孫虎

(1.中國科學(xué)院昆明植物研究所 資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物醫(yī)生研發(fā)中心，云南 昆明 650201)

植物利用光能進(jìn)行光合作用，通過光反應(yīng)產(chǎn)生的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)和NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)在暗反應(yīng)中被用于固定二氧化碳(CO2)并轉(zhuǎn)化為合成有機(jī)物。光反應(yīng)中的光合電子傳遞分為線性電子傳遞、圍繞光系統(tǒng)I(PSI)的環(huán)式電子傳遞、假環(huán)式電子傳遞等[1]。光合電子傳遞的運(yùn)轉(zhuǎn)形成跨類囊體膜質(zhì)子驅(qū)動勢，驅(qū)動ATP合成酶合成ATP[2]。線性電子傳遞產(chǎn)生的ATP/NADPH比值大約為1.29，暗反應(yīng)所需的ATP/NADPH比值大概為1.6，所以植物需要其他的替代電子傳遞途徑來補(bǔ)充ATP的合成[3]。環(huán)式電子傳遞產(chǎn)生的跨類囊體膜質(zhì)子梯度不僅補(bǔ)充ATP的合成，并且通過調(diào)節(jié)光合電子傳遞鏈的氧化還原態(tài)保護(hù)PSI和光系統(tǒng)II(PSII)免受過剩光能的損傷[4]。非生物脅迫對PSII活性的影響主要集中在單因子脅迫(高溫、低溫、強(qiáng)光、干旱等)[5-8]，但是目前關(guān)于植物對高溫和強(qiáng)光復(fù)合脅迫的光合生理響應(yīng)還了解較少。

中等程度高溫會對PSII的放氧復(fù)合體活性造成損傷[9]，進(jìn)而引起PSII的光抑制[10]。與此同時，高溫導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，抑制卡爾文循環(huán)，增加葉綠體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生[11]。活性氧自由基會抑制D1蛋白的合成，進(jìn)而影響PSII活性的快速修復(fù)[12-13]。所以，高溫脅迫不僅會提高損傷速率，還會降低修復(fù)速率[14]。在強(qiáng)光條件下，過剩光能大部分通過非光化學(xué)淬滅以無害的形式耗散(熱耗散)，避免PSII的修復(fù)受到抑制[7,15-16]。熱耗散的激發(fā)依賴于跨類囊體膜質(zhì)子梯度(ΔpH)的建立，而ΔpH的建立又依賴線性電子傳遞和環(huán)式電子傳遞[17]，光合電子傳遞的運(yùn)轉(zhuǎn)受PSI和PSII活性的控制[18-20]。所以，在高溫和強(qiáng)光復(fù)合脅迫下，PSII的損傷有可能抑制線性電子傳遞并影響跨類囊體膜質(zhì)子梯度的建立，從而加劇光抑制的發(fā)生。

高溫脅迫也會對PSI的活性造成影響，研究表明42 ℃的中等程度高溫和300 μmol/(m2·s1)光照處理10 h就會對小麥(Triticumaestivum)的PSI活性造成嚴(yán)重?fù)p傷，且損傷程度要高于PSII[5]。這主要是高溫加劇了類囊體膜的質(zhì)子滲漏，降低了ΔpH[21]，進(jìn)而造成PSI的電子載體處于過度還原態(tài)，引發(fā)PSI內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生，造成PSI受損。此外，42 ℃的中等程度高溫會加劇波動光強(qiáng)下煙草(Nicotianatabacum)幼葉的PSI損傷程度[22]。但是，中等程度高溫和持續(xù)恒定強(qiáng)光對PSI活性的影響還缺乏研究。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是一種有重要藥用價值的蘭科(Orchidaceae)植物，在亞熱帶地區(qū)被廣泛種植。但是，目前關(guān)于逆境脅迫對鐵皮石斛光合機(jī)構(gòu)及光合電子傳遞影響的研究還十分欠缺。由于高溫和強(qiáng)光復(fù)合脅迫在鐵皮石斛種植地區(qū)的夏季經(jīng)常出現(xiàn)，因此本研究將以鐵皮石斛“昆植1號”品種為研究對象，研究高溫和強(qiáng)光復(fù)合脅迫對其PSI和PSII的影響及其光合生理機(jī)制，為鐵皮石斛的種植策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

供試材料為種植在中國科學(xué)院昆明植物研究所溫室內(nèi)的鐵皮石斛品種“昆植1號”。鐵皮石斛“昆植1號”植株被栽培在直徑為20 cm的透水塑料盆中，以樹皮為基質(zhì)。生長季晝夜溫度為20/30 ℃，空氣濕度維持在60%左右，光照條件為全光照的40%。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將鐵皮石斛植株在常溫下暗適應(yīng)30 min后，放入42 ℃溫室中繼續(xù)暗適應(yīng)5 min，然后利用Dual-PAM 100雙通道葉綠素?zé)晒鈨x(德國Walz公司)測定葉綠素?zé)晒饪焖賱恿W(xué)曲線(300 ms)和Pm值，分析處理前葉片的PSII和PSI活性。隨后暗適應(yīng)5 min，然后測定強(qiáng)光〔1 809 μmol/(m2· s)〕處理過程中PSI和PSII參數(shù)的變化。處理60 min后，再暗適應(yīng)30 min測定葉綠素?zé)晒饪焖賱恿W(xué)曲線和Pm值，分析處理后葉片的PSII和PSI活性。通過比較處理前后PSII和PSI活性的差異，判斷高溫強(qiáng)光處理對PSII和PSI活性的損傷程度。

1.3 指標(biāo)測定

PSI和PSII參數(shù)的測定都利用Dual-PAM 100雙通道葉綠素?zé)晒鈨x(德國Walz公司)完成。葉綠素?zé)晒饪焖賱恿W(xué)曲線的測定使用20 000 μmol/(m2· s)的強(qiáng)光脈沖(300 ms)，葉綠素相對熒光強(qiáng)度的快速動力學(xué)曲線利用最大熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。PSII的參數(shù)計(jì)算如下[23]：

Y(II)=(Fm′ -Fs)/Fm′；NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′；Y(NO)=Fs/Fm。

式中：Fm代表暗適應(yīng)后的最大葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度;Fm′代表光適應(yīng)后的最大葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度;Fs代表光適應(yīng)后的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度;Y(II)表示PSII的有效光化學(xué)量子產(chǎn)額;NPQ表示PSII的非光化學(xué)淬滅能力;Y(NO)表示PSII的非調(diào)節(jié)性熱耗散量子產(chǎn)額。PSI的參數(shù)計(jì)算如下[22]：

Y(I)=(Pm′-P)/Pm；Y(ND)=P/Pm；Y(NA)=(Pm-Pm′)/Pm。

式中：Y(I)代表光PSI的光化學(xué)量子產(chǎn)額，Y(ND)代表PSI反應(yīng)中心P700的氧化態(tài)比例，Y(NA)代表PSI反應(yīng)中心P700的還原態(tài)比例。光合電子傳遞速率的計(jì)算如下：

ETRI = PPFD×Y(I)×0.84×0.5；ETRII = PPFD×Y(II)×0.84×0.5。

式中：ETRI和ETRII分別代表通過PSI和PSII的電子傳遞速率，ETRI-ETRII代表環(huán)式電子傳遞速率[24]，PPFD代表光合有效輻射強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究的每組實(shí)驗(yàn)測定包括5個重復(fù)，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。處理前后的數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫強(qiáng)光脅迫對葉綠素快速動力學(xué)曲線的影響

高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛葉綠素影響見圖1。

圖1 高溫強(qiáng)光處理對鐵皮石斛葉綠素?zé)晒饪焖賱恿W(xué)曲線的影響

在42 ℃的中等高溫脅迫下對鐵皮石斛葉片進(jìn)行強(qiáng)光〔1 809 μmol/(m2· s〕處理60 min后，測定其葉綠素?zé)晒饪焖賱恿W(xué)曲線(OJIP曲線)，發(fā)現(xiàn)J點(diǎn)、I點(diǎn)和P點(diǎn)的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度都發(fā)生大幅度下降(圖1A)，表明PSII活性受到了嚴(yán)重?fù)p傷。此外，在300 μs時的相對葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度(K點(diǎn))發(fā)生了顯著上升(圖1B)，表明PSII的電子供體即放氧復(fù)合體活性受到了明顯的損傷。

2.2 高溫強(qiáng)光脅迫對PSII光量子產(chǎn)額的影響

高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛PSII光量子產(chǎn)額的影響見圖2。

圖2 高溫強(qiáng)光處理對鐵皮石斛光系統(tǒng)II量子產(chǎn)額的影響

在暗適應(yīng)葉片突然曝光的前1 min內(nèi)，鐵皮石斛的PSII光化學(xué)量子產(chǎn)額[Y(II)]維持在很高水平(圖2A)，這主要和水-水循環(huán)介導(dǎo)的PSII電子傳遞相關(guān)。在高溫和強(qiáng)光處理過程中，Y(II)在前6 min內(nèi)大幅度下降(圖2A)，說明鐵皮石斛的卡爾文循環(huán)受到了高溫脅迫的強(qiáng)烈抑制，導(dǎo)致線性電子傳遞產(chǎn)生的ATP和NADPH不能被及時消耗，NADP+/NADPH的比例下降，影響了電子從PSII經(jīng)過PSI再傳遞給NADP+的過程。在高溫和強(qiáng)光處理60 min后，鐵皮石斛的NPQ從2.4下降到0.43，下降幅度達(dá)到了82%(圖2B)。NPQ的激發(fā)不僅依賴跨類囊體膜質(zhì)子梯度，同時還受PSII復(fù)合體核心活性的影響，前者和后者對NPQ的貢獻(xiàn)分別大概為60%和40%。所以，鐵皮石斛經(jīng)高溫和強(qiáng)光處理后NPQ的大幅度下降不僅和跨類囊體膜質(zhì)子梯度的不足有關(guān)，同時還涉及PSII反應(yīng)中心的受損。當(dāng)NPQ能力不足時，PSII吸收的大部分光能就變成了過剩光能，引起Y(NO)的大幅度上升(圖2C)。Y(NO)的大幅度上升會引起活性氧自由基在PSII復(fù)合體處大量產(chǎn)生，進(jìn)而影響D1蛋白的合成和PSII的修復(fù)過程。

2.3 高溫強(qiáng)光脅迫對PSI量子產(chǎn)額的影響

高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛PSI光量子產(chǎn)額的影響見圖3。

圖3 高溫強(qiáng)光處理對鐵皮石斛光系統(tǒng)I量子產(chǎn)額的影響

與Y(II)類似，在暗適應(yīng)葉片突然曝光的前1 min內(nèi)，鐵皮石斛的PSI光化學(xué)量子產(chǎn)額[Y(I)]維持在很高水平(圖3A)，這主要和水-水循環(huán)及環(huán)式電子傳遞的高度激發(fā)有關(guān)。在高溫和強(qiáng)光處理過程中，Y(I)在前6 min內(nèi)大幅度下降，隨后緩慢下降(圖3A)。PSI的反應(yīng)中心在暗適應(yīng)突然曝光后的20 s就高度氧化(圖3B)，說明水-水循環(huán)在高溫處理的初期耗散了積累在PSI的過?；罨娮?，避免其出現(xiàn)過度還原態(tài)(圖3C)。但是，在隨后的高溫強(qiáng)光處理過程中，PSI的氧化態(tài)比例逐漸下降(圖3B)，過度還原態(tài)比例逐漸上升(圖3C)，這主要和PSI的逐漸受損相關(guān)。

2.4 高溫強(qiáng)光脅迫對光合電子傳遞的影響

高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛光合電子傳遞的影響見圖4。

圖4 高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛光合電子傳遞速率的影響

在暗適應(yīng)葉片突然曝光的前1 min內(nèi)，PSI電子傳遞速率(ETRI)維持在很高水平(圖4A)，這主要是因?yàn)樗?水循環(huán)和環(huán)式電子傳遞都高度激發(fā)。在隨后的處理過程中，水-水循環(huán)介導(dǎo)的PSII電子傳遞大幅度下降(圖4B)，并且環(huán)式電子傳遞的激發(fā)受到抑制(圖4C)，導(dǎo)致ETRI快速下降。值得注意的是，在高溫強(qiáng)光處理5 min以后，環(huán)式電子傳遞的活性基本喪失(圖4C)，這會嚴(yán)重影響跨類囊體膜質(zhì)子梯度的構(gòu)建，進(jìn)而抑制NPQ的激發(fā)。

2.5 高溫強(qiáng)光脅迫對PSI和PSII活性的影響

經(jīng)過60 min高溫和強(qiáng)光處理后，最大葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度(Fm)下降了78%，表明PSII活性受到嚴(yán)重?fù)p傷。與此同時，最大可氧化的P700值(Pm)下降了31%，說明PSI活性也出現(xiàn)了中等程度損傷。相比較PSII活性而言，PSI活性的受損程度較低，這說明PSII是高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛造成光損傷的主要靶點(diǎn)。

圖5 高溫強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛光系統(tǒng)I和II活性的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

自然條件下，高溫和強(qiáng)光脅迫是植物在夏季經(jīng)常遭遇的非生物逆境脅迫，但這種復(fù)合脅迫對植物葉片PSI和PSII的影響還有待揭示。有研究表明，42 ℃和中等光強(qiáng)復(fù)合脅迫對小麥PSI活性的影響大于其對PSII活性的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在42 ℃下強(qiáng)光脅迫處理60 min后鐵皮石斛的最大葉綠素?zé)晒庵?Fm)下降了78%，表明其PSII活性受到嚴(yán)重?fù)p傷[20]。與此同時，其最大可氧化的P700值(Pm)下降了31%，表明PSI活性也有顯著的下降[22,25-26]。所以，高溫和強(qiáng)光脅迫對鐵皮石斛PSII活性的影響大于其對PSI活性的影響。此外，通過PSI和PSII的電子傳遞速率分別下降91%和86%，說明PSI和PSII的損傷對整個光合電子傳遞鏈的功能造成了嚴(yán)重影響。

PSII的損傷程度由損傷速率和修復(fù)速率共同決定，當(dāng)損傷速率大于修復(fù)速率時，PSII活性發(fā)生損傷[27]。反之，當(dāng)修復(fù)速率大于損傷速率時，PSII活性得到修復(fù)[28]。在自然條件下，強(qiáng)光導(dǎo)致的PSII損傷會在弱光條件下修復(fù)[29]。PSII的損傷速率主要和光照強(qiáng)度相關(guān)，但修復(fù)速率會受到其他環(huán)境因素的影響，例如鹽脅迫、溫度脅迫等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫和強(qiáng)光復(fù)合脅迫處理對鐵皮石斛的放氧復(fù)合體活性造成顯著性損傷，這和PSII損傷的“兩步模型”相吻合。在“兩步模型”中，放氧復(fù)合體是PSII損傷的最初靶點(diǎn)，放氧復(fù)合體的受損隨后引起PSII的損傷[30]。在逆境條件下，葉片的光能利用效率下降，導(dǎo)致活性氧自由基的含量上升?；钚匝踝杂苫鶗种芇SII復(fù)合體關(guān)鍵亞基D1蛋白的重新合成，進(jìn)而影響D1蛋白和受損PSII復(fù)合體的組裝，限制PSII活性的修復(fù)。所以，環(huán)境脅迫對PSII修復(fù)速率的影響主要和活性氧自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)[10]。當(dāng)暗適應(yīng)葉片在42 ℃下突然曝光后，其PSII電子傳遞速率(ETR II)先保持在較高水平，然后急速下降，這主要和水-水循環(huán)電子傳遞的短暫激發(fā)相關(guān)，此時水-水循環(huán)電子傳遞的運(yùn)轉(zhuǎn)避免了PSI處于過度還原態(tài)，也消耗了PSII的部分過剩光能。但是，在隨后的高溫強(qiáng)光處理過程中，ETR II逐漸下降并維持在較低的水平，說明鐵皮石斛的暗反應(yīng)受到限制。高溫容易引起卡爾文循環(huán)的受限，導(dǎo)致NADPH的消耗速率變慢，引起NADP+的缺失，進(jìn)而造成電子從PSI到NADP+的傳遞受阻，最終導(dǎo)致ETRII受限，引發(fā)活性氧自由基的大量產(chǎn)生，從而抑制PSII活性的修復(fù)。此外，非光化學(xué)淬滅(NPQ)作為PSII耗散過剩光能的主要保護(hù)機(jī)制，在高溫強(qiáng)光脅迫處理60 min后大幅度下降，這也加劇了PSII內(nèi)部活性氧自由基的產(chǎn)生。所以，在42 ℃和強(qiáng)光復(fù)合脅迫條件下，較高的PSII損傷速率和較低的PSII修復(fù)速率協(xié)同作用，導(dǎo)致鐵皮石斛的PSII活性嚴(yán)重受損。

PSII活性雖然容易受損，但是在合適條件下只需要幾個小時就能夠基本修復(fù)[31]。而PSI活性則不同，一旦受損就需要一周甚至更長時間才能完全修復(fù)[18,32]。PSI的損傷主要是由于其反應(yīng)中心附近的電子載體處于過度還原態(tài)，造成PSI復(fù)合體內(nèi)部產(chǎn)生大量的活性氧自由基，進(jìn)而引發(fā)氧化損傷[33]。在正常生長條件下，葉片產(chǎn)生較高的跨類囊體膜質(zhì)子梯度(ΔpH)，在Cyt b6f復(fù)合體處調(diào)節(jié)PSII到PSI的電子傳遞，保證PSI的電子載體在強(qiáng)光條件下都處于高度氧化態(tài)，進(jìn)而避免過度還原引起的光損傷[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛的PSI電子載體在高溫強(qiáng)光脅迫處理的初期并沒有發(fā)生過度還原，但是在處理后期PSI電子載體出現(xiàn)過度還原并伴隨著光損傷。ΔpH在調(diào)控PSI氧化還原態(tài)過程中發(fā)揮重要作用，例如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)環(huán)式電子傳遞突變體pgr5中，強(qiáng)光條件下ΔpH的建立不足導(dǎo)致其PSI發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，甚至造成植株死亡[36-39]。所以，環(huán)式電子傳遞是植物在強(qiáng)光條件下建立充分的ΔpH并保護(hù)PSI活性的重要替代電子傳遞途徑[1,40]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在高溫強(qiáng)光脅迫處理的初期，鐵皮石斛的環(huán)式電子傳遞被高度激發(fā)。但是在處理后期，環(huán)式電子傳遞的激發(fā)程度很低，這就導(dǎo)致ΔpH的建立不足。同時，由于NPQ的激發(fā)也依賴ΔpH的建立，因此高溫強(qiáng)光處理后NPQ的下降也證實(shí)了ΔpH的建立受限。所以，長期的高溫強(qiáng)光脅迫會導(dǎo)致環(huán)式電子傳遞失活，引起ΔpH的建立不足，進(jìn)而引起PSI活性受損。

3.2 結(jié)論

高溫脅迫對光系統(tǒng)II活性及光量子產(chǎn)額的影響是導(dǎo)致其光合作用機(jī)構(gòu)受損的重要方面[41-44]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高溫強(qiáng)光復(fù)合脅迫處理60 min后，鐵皮石斛的PSI和PSII活性都顯著下降，且PSII的下降幅度更大，表明PSII活性的受損是鐵皮石斛難以適應(yīng)長期高溫強(qiáng)光復(fù)合脅迫的重要原因。提高光能利用效率是維持植物生長和提高產(chǎn)量的基礎(chǔ)，而負(fù)責(zé)光反應(yīng)的PSI和PSII活性是決定光能利用效率的重要因素。鑒于高溫強(qiáng)光脅迫會對鐵皮石斛的PSI和PSII活性造成嚴(yán)重?fù)p傷，在鐵皮石斛種植條件的選擇和控制上，應(yīng)盡量避免高溫和強(qiáng)光復(fù)合脅迫。本研究的設(shè)計(jì)思路和實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于其他農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物種植策略的選擇同樣具有參考和借鑒意義。