李勇鵬，潘莉，寧德魯，耿樹香，張艷麗

(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201)

核桃是重要的干果和木本油料樹種，我國的主要栽培種有普通核桃(Juglansregia)和深紋核桃(J.sigillata)2個(gè)種[1]，其中深紋核桃主要分布在云南、貴州、四川西部和西藏雅魯藏布江中下游地區(qū)[2]，是西南地區(qū)的核桃主要栽培種。隨著核桃栽培面積和產(chǎn)量的不斷提升，核桃產(chǎn)品呈現(xiàn)多樣化的發(fā)展趨勢。核桃鮮果由于具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感，且營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于核桃干果，越來越受到消費(fèi)者的喜愛，有很好的市場前景[3]。然而核桃鮮果由于水分含量較高，極易發(fā)生霉變而失去商品價(jià)值[4]。關(guān)于引起核桃霉變的病原菌及其抑制措施已有一些研究，但研究材料主要為普通核桃[5-7]，關(guān)于深紋核桃霉變的研究尚未見報(bào)道。云南省核桃種植面積已超286.67×104hm2，其種植面積和產(chǎn)量均居全國第一，主栽品種漾濞泡核桃為深紋核桃[1]。本文以新鮮的漾濞泡核桃為研究對象，研究了在冷藏(2±1 )℃條件下核桃鮮果霉菌數(shù)量的變化及主要的霉菌種類，以期為云南鮮食核桃的貯藏提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料 漾濞泡核桃，2019年9月11日采自云南省大理州漾濞縣馬廠核桃林場，脫去青皮后用清水漂洗，晾干果殼表面的水分。

孟加拉紅培養(yǎng)基 蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂15 g，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g，加入水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g,加水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 材料處理

本實(shí)驗(yàn)在云南省林業(yè)和草原科學(xué)院木本油料工程中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，對核桃殼果采用兩種試劑進(jìn)行處理：處理P試劑為ClO2，配制成濃度為80 mg/L的水溶液；處理Q試劑為核桃青皮提取物，青皮提取物的制備方法參考王小雙等[8]的方法，配制成濃度為10 g/L的水溶液。將核桃樣品分別浸泡于兩種溶液中10 s，取出后晾干表面水分。設(shè)對照組(CK)，不用試劑處理。每個(gè)處理100個(gè)核桃殼果，重復(fù)3次，處理好的新鮮核桃裝筐后套上硅窗保鮮袋放入冷庫保存。實(shí)驗(yàn)至新鮮核桃果殼表面發(fā)生明顯霉變時(shí)終止。

1.3 霉菌總數(shù)的測定方法

參照GB 4789.15—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[9]的方法進(jìn)行，采用平板菌落計(jì)數(shù)法。樣品在冷庫保存20 d后，每隔10 d取一次樣。稱取25 g樣品，加入無菌水制成1︰10的樣品溶液。(1)核桃殼果樣品：將殼果與無菌水充分振搖，制成菌懸液；(2)核桃仁樣品：核桃仁加入無菌水后用果蔬攪拌機(jī)打成勻漿。

取1 mL的1︰10樣品溶液加入裝有9 mL無菌水的試管中，充分混勻得到1︰100倍的樣品溶液。根據(jù)樣品的污染程度，制作10倍梯度稀釋樣品溶液，選擇3個(gè)稀釋度的樣品溶液，分別吸取1 mL樣品勻液放入2個(gè)無菌平皿內(nèi)，及時(shí)將20～25 mL冷卻至約46 ℃的孟加拉紅瓊脂傾注平皿，充分混勻，置水平臺(tái)面待培養(yǎng)基完全凝固。同時(shí)分別取1 mL無菌水注入于2個(gè)無菌平皿，傾注培養(yǎng)基作空白對照。瓊脂凝固后，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。結(jié)果以菌落形成單位(colony-forming units,CFU)表示，用肉眼觀察記錄菌落數(shù)。

1.4 霉菌分離與種類鑒定

1.4.1 核桃殼果主要霉菌的分離、純化及保存

霉菌的分離采用梯度平板稀釋法，結(jié)合霉菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)開展，觀察孟加拉紅培養(yǎng)基長出的各菌落的形態(tài)、顏色及菌絲形狀，挑取數(shù)量和頻率都較高的菌落邊緣菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上。觀察菌落在PDA培養(yǎng)基上正反面的形態(tài)，對不純的菌落轉(zhuǎn)接純化。純化后的菌種接種于PDA試管斜面保存。

1.4.2 菌株的形態(tài)學(xué)特征鑒定

從純化培養(yǎng)的菌落上挑取少許菌絲制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察真菌特征。主要包括菌絲顏色、有無隔膜，孢子形態(tài)、大小及著生狀態(tài)等，根據(jù)《真菌鑒定手冊》[10]等資料鑒定霉菌的種類。

1.4.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將純化后的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，刮取約0.1 g菌絲體，置于2.0 mL的滅菌離心管中，采用(Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit)方法提取菌株的DNA。用真菌通用引物ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)、ITS1-F(5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3′)對菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段包括ITS1-5、8S-ITS2片段。PCR擴(kuò)增體系為：25 μL的2×TSINGKE Master Mix，濃度為10 μM的引物ITS4和ITS1-F各1 μL，模板DNA 2 μL，加dd H2O至總體積為50 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電脈檢測，將亮度清晰且條帶范圍在500～1 600 bp的PCR產(chǎn)物送上海生工(生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)測序。測序結(jié)果首先運(yùn)用DNASTAR軟件中SeqMan程序?qū)y序結(jié)果的膠圖進(jìn)行校正，去掉兩端信號不好的部分，保存校正后序列。重新使用SeqMan程序，將所有校正后序列導(dǎo)入軟件，進(jìn)行相似度比對。將所有序列按97%的相似度進(jìn)行聚類，保存聚類結(jié)果。選取每個(gè)聚類組的代表序列進(jìn)行在線NCBI 的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性比對，選取相似度高的參考序列。將聚類組的代表序列和參考序列導(dǎo)入MEGA 7軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

1.4.4 致病性測定

為驗(yàn)證分離的真菌是否會(huì)引起核桃霉變，將菌絲接種于消毒好的核桃仁表面。將核桃破殼取仁，將核桃仁放在75%的酒精中消毒5 min，再用無菌水沖洗4次，隨后置于滅菌的平板中。挑取少許菌絲置于核桃仁的表面接種，以不接菌的核桃仁為對照。將平板貼好封口膜，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察霉變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對核桃殼果霉菌生長的影響

核桃果在貯藏初期的霉菌數(shù)量較低，隨著貯藏時(shí)間的增加而增長。核桃殼表面的霉菌數(shù)量初期較低，在40 d后開始快速增長(圖1)。后期的霉菌數(shù)量為CK>ClO2處理組(處理P)>核桃青皮提取液處理組(處理Q)，表明用ClO2和核桃青皮提取物處理核桃殼果，都對核桃殼果表面的霉菌生長有一定的抑制作用，而且核桃青皮提取物對霉菌的抑制效果更好。

圖1 核桃殼果表面不同時(shí)間下的霉菌數(shù)量注：處理P試劑為ClO2，處理Q試劑為 核桃青皮提取物，CK為對照組,圖2同。Fig.1 Number of mould on the surface of walnut husk during storage

核桃仁的霉菌數(shù)量在貯藏的前50 d保持在較低的水平，之后開始快速增長，2個(gè)處理組與對照組的霉菌數(shù)量相差不大(圖2)。與果殼表面的霉菌數(shù)量相比，核桃仁的霉菌數(shù)量較少。用青皮提取物(處理Q)和ClO2(處理P)處理殼果的表面，對殼果表面的霉菌數(shù)量有抑制作用，而對核桃仁的霉菌數(shù)量無明顯的抑制作用，可能是由于果殼的保護(hù)作用，殼表面的霉菌和仁的霉菌沒有緊密的關(guān)聯(lián)。

圖2 核桃仁的霉菌總數(shù)Fig.2 Number of mould in the walnut kernel during storage

2.2 主要霉菌種類分離鑒定及致病性驗(yàn)證

2.2.1 形態(tài)鑒定

從核桃殼果和核桃仁分離的真菌種類較多，出現(xiàn)頻率最多的有2種菌，標(biāo)記為HTM1-1和HTM1-2。HTM1-1在PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落邊緣為白色絨毛狀，中間為灰綠色粉粒狀霉層，表面干燥。分生孢子梗無色，帚狀分枝，孢子灰綠色，卵圓形串生(圖3)。根據(jù)其形態(tài)特征，初步將HTM1-1鑒定為擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)。HTM1-2在PDA培養(yǎng)基上生長很快，菌絲致密，氣生菌絲較長，菌絲初期白色，后菌落中間呈現(xiàn)粉色或黃褐色，菌落表面呈現(xiàn)環(huán)紋。HTM1-2的新生菌絲無色，成熟菌絲黃褐色，菌絲有明顯的隔膜，成熟菌絲的分隔膨大呈連續(xù)的節(jié)狀。在PDA培養(yǎng)基上HTM1-2未觀察到大型分生孢子，而在核桃仁培養(yǎng)的菌絲具有典型的鐮刀菌屬(Fusarium)的大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子(圖4)。根據(jù)其形態(tài)特征，將HTM1-2鑒定為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)。

圖3 擴(kuò)展青霉在PDA培養(yǎng)基生長形態(tài)及其顯微形態(tài)(×100)

圖4 木賊鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基的形態(tài)及其顯微形態(tài)(×100)

參照管斌等[11]等的方法，將2種霉菌分別接種于消毒后的核桃仁，對其致病性進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，接種了霉菌的核桃仁出現(xiàn)了和鮮果貯藏后期相同的霉變，未接種的核桃仁沒有發(fā)生霉變(圖5)。接種了擴(kuò)展青霉的核桃仁表面長出了灰綠色的霉層，接種了木賊鐮刀菌的核桃仁長出了白色長絲狀菌絲。將霉變核桃仁上的霉菌分離并在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到了與接種菌株形態(tài)特征相同的菌株，證實(shí)了擴(kuò)展青霉和木賊鐮刀菌是引起核桃鮮果長出青黑色霉點(diǎn)和白色霉點(diǎn)的致病菌。

圖5 核桃仁接種霉菌后的霉變情況注：A為CK，B為擴(kuò)展青霉，C為木賊鐮刀菌Fig.5 The pathogenecity of isolated fungi

2.2.2 霉菌rDNA-ITS序列分析及鑒定

將HTM1-1和HTM1-2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，測序得其ITS序列。測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們分別與擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)和木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)的相似性達(dá)到99.83%和100.00%。將分離菌株的序列和參考序列用Mega 7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，這2種分離菌株的序列分別與對應(yīng)的參考序列聚為一枝。綜合分子比對結(jié)果和形態(tài)特征鑒定，將這2種霉菌鑒定為擴(kuò)展青霉和木賊鐮刀菌。

圖6 分離菌株基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on ITS sequences of isolated fungi

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，在低溫貯藏條件下新鮮核桃殼果表面的霉菌數(shù)量在40 d后開始快速增加，核桃仁的霉菌數(shù)量50 d后開始快速增加。用核桃青皮提取物和ClO2溶液處理核桃殼果，對核桃仁霉菌生長的影響不明顯，但對殼果表面的霉菌生長都有明顯的抑制作用，其中核桃青皮提取物的抑菌效果優(yōu)于ClO2。已有研究表明，核桃青皮提取物有較好的抑菌活性[12-13]，而且具有一定的藥用保健價(jià)值[8]。云南核桃的殼果表面紋路較深，果殼凹陷處易發(fā)生霉變影響商品的品質(zhì)。核桃青皮提取物能較好的抑制殼果表面霉菌的生長，而且材料易得，價(jià)格低廉，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

核桃鮮果由于水分含量高，在冷藏過程中極易發(fā)生霉變，防止霉變是核桃鮮果貯藏中需要特別重視的問題。本研究對低溫貯藏條件下引起深紋核桃鮮果霉變的主要霉菌種類進(jìn)行了分離、純化、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并對分離的霉菌開展了致病性測定，結(jié)果表明引起核桃霉變的主要種類為擴(kuò)展青霉和木賊鐮刀菌。擴(kuò)展青霉會(huì)在核桃種殼和內(nèi)種皮上形成灰綠色的霉點(diǎn)和霉層，木賊鐮刀菌引起白毛狀霉變。擴(kuò)展青霉可導(dǎo)致多種水果腐敗變質(zhì)，引發(fā)蘋果(Malussieversii)、櫻桃(Cerasuspseudocerasus)、油桃(Prunuspersicavar.nectarina)、水蜜桃(Prunuspersica)等水果的青霉病，造成生產(chǎn)和采后損失[14]。擴(kuò)展青霉會(huì)分泌展青霉素，展青霉素可引起細(xì)胞氧化損傷，甚至誘發(fā)癌癥，若殘留在食品中，會(huì)對食用者健康造成極大危害[15]。鐮刀菌是一類重要的植物病原菌，可引起植物的根莖葉果實(shí)腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[16]。引起鮮食核桃霉變真菌的主要種類已有相關(guān)報(bào)道，耿陽陽等[7]從貴州省貯藏期霉?fàn)€的鮮核桃上分離的霉菌有毛霉屬(Mucor)、鐮孢菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)，黃凱等[17]分離鑒定了陜西省鮮食核桃貯藏過程的霉菌，得出主要的致病菌為擴(kuò)展青霉。由于生長環(huán)境和品種的不同，引起鮮食核桃發(fā)生霉變的霉菌類型會(huì)有所不同。云南核桃栽培歷史悠久，品種繁多，各栽培區(qū)氣候條件差異較大。本文以云南核桃主栽品種為研究對象，研究了云南核桃鮮果主產(chǎn)區(qū)的果實(shí)在貯藏期間的霉變情況和霉菌種類，其他品種和栽培區(qū)的霉菌種類和霉變情況有待進(jìn)一步的研究。本研究通過分離鑒定，發(fā)現(xiàn)云南核桃主栽品種漾濞泡核桃在貯藏期間引起霉變的主要真菌為擴(kuò)展青霉和木賊鐮刀菌。由于這2種真菌都是產(chǎn)毒素真菌，在將來的鮮食核桃貯藏研究中，需針對這2種霉菌的生長繁殖特性進(jìn)一步開發(fā)抑制果實(shí)霉變的方法。