常 悅，李俊凱，陳順順，徐漢虹

（1.長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025；2.華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642）

內(nèi)吸傳導性農(nóng)藥在植物體內(nèi)的傳導方式直接影響農(nóng)藥的使用方法和防治效果［1，2］，是農(nóng)藥創(chuàng)制的研究熱點［3-5］。改善農(nóng)藥的傳導性，可影響農(nóng)藥在植物中的富集部位、持效時間、代謝過程和殘留動態(tài)等毒理學行為［6］，對高效防治病害、減少農(nóng)藥用量、指導農(nóng)藥合理使用具有重要意義。已有研究表明，植物內(nèi)源化合物與農(nóng)藥分子相偶聯(lián)可以提高農(nóng)藥在植物體內(nèi)的傳導性［7-10］。在眾多內(nèi)源物質(zhì)中，氨基酸在植物生命活動中發(fā)揮著重要作用，并可通過導管和篩管在植物的不同組織器官間傳導。長江大學農(nóng)學院農(nóng)藥課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，申嗪霉素與氨基酸耦聯(lián)可以改善申嗪霉素在蓖麻韌皮部的傳導［11，12］；Xie等［13］研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸轉運蛋白參與了甘氨酸-氟蟲腈復合物在蓖麻韌皮部的吸收與傳導。所以將氨基酸與農(nóng)藥分子進行結合，在不改變其各自活性位點的前提下，有望得到能被氨基酸載體轉運的新化合物分子。

拌種靈（Amicarthiazol）是一種廣譜、高效的內(nèi)吸性殺菌劑，屬于噻唑類殺菌劑，可用于防治擔子菌引起的禾谷類作物病害［14，15］。為了探究拌種靈的內(nèi)吸傳導量，改善拌種靈在植物體內(nèi)的傳導性，本研究在保留拌種靈噻唑基團與谷氨酸的氨基、羧酸結構的前提下，將拌種靈與谷氨酸進行耦聯(lián)，合成了谷氨酸-拌種靈耦合物，并對其活性及傳導性進行了初步研究。

目標化合物的合成路線如圖1所示。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）由長江大學植物病理實驗室提供。煙草品種為RG17，由云南紅塔集團有限公司提供，于培養(yǎng)箱內(nèi)催芽育苗，移栽入網(wǎng)室后自然生長至10～12葉期供試驗使用。

1.2 主要試劑與儀器

L-谷氨酸由上海生化試劑公司生產(chǎn)；97%（質(zhì)量分數(shù)，下同）拌種靈原粉由江蘇南通江山農(nóng)藥化工股份公司提供；95%的氯代甲酸芐酯由江蘇省新沂市匯力精細化工有限公司生產(chǎn)；40%溴化氫（HBr）的冰醋酸溶液由湖北省南漳縣襄九精細化工有限責任公司提供；多聚甲醛、對甲苯磺酸、氯化亞砜等化學試劑為市售分析純。

Bruker Avance DPX400型核磁共振儀，瑞士布魯克公司；Agilent 1100 HPLC儀，美國安捷倫公司；LABOROTA 4001型旋轉蒸發(fā)儀，德國博勵行公司。WRR熔點測定儀，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 化合物的合成

1.3.1 N-芐氧羰基-α-氨基谷氨酸的合成（2） 將0.1 mol（14.7 g）L-谷氨酸溶于飽和NaHCO3溶液。冰浴條件下，緩慢滴加0.11 mo（l18.9 g）氯代甲酸芐酯，滴加完畢緩慢升至室溫，反應24 h。反應結束，水相用30 mL乙醚洗滌，然后用6 mol/L的HCl酸化至pH為2，用乙酸乙酯（50 mL×3）萃取，無水MgSO4干燥，減壓濃縮至干，得白色固體產(chǎn)物（2），重25 g，產(chǎn)率89%。

1.3.2 3-（3′-（芐氧羰基）-5′-氧代惡唑烷酮-4′-基）-丙氨酸的合成（3） 將0.04 mol（11.25 g）化合物（2）溶于200 mL甲苯，配備Dean-Stark分水蒸餾器和回流冷凝管，加入0.08 mol（2.4 g）多聚甲醛和0.002 4 mo（l0.46 g）對甲苯磺酸。體系回流反應約3 h。冷卻，加入50 mL乙酸乙酯，分離有機相，用4 mL 0.3 mol/L K2CO3溶液洗滌，再水洗3次，無水MgSO4干燥，減壓濃縮，得化合物（3），為黏稠狀液體，產(chǎn)率81%。

1.3.3 3-（3-（芐氧羰基）-5-氧代惡唑烷酮-4-基）-丙氨酰氯的合成（4） 長頸燒瓶中加入0.01 mol（2.93 g）化合物（3）、0.05 mol（3.7 mL）氯化亞砜及2 mL四氯化碳，配置冷凝和干燥設備，回流反應至無氣體放出，蒸去溶劑，加入干燥的二氯甲烷10 mL，蒸去溶劑，得化合物（4），直接進入下一步反應。

1.3.4 3-（3-（芐氧羰基）-5-氧代惡唑烷酮-4-基）-丙酰-（4′-甲基-5′-苯氨羰基）-噻唑-2-基-胺的合成（6） 將拌種靈原藥（5）0.01 mo（l2.33 g）溶于25 mL干燥的四氫呋喃中，通入干燥氮氣，加入1.1 mL三乙胺，冰浴中分次少量滴加0.01 mol化合物（4）。60℃回流反應3 h，冷卻至室溫，反應15 h，薄層色譜跟蹤反應進程。反應結束，減壓蒸發(fā)除去四氫呋喃，體系溶于50 mL二氯甲烷中，依次用15 mL水、15 mL HCl溶液（0.5 mol/L）、15 mL飽和NaHCO3溶液洗滌，再用水洗滌至中性。有機相用無水MgSO4干燥，蒸去溶劑，柱層析純化（V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1）。得到白色固體產(chǎn)物（6），產(chǎn)率72%。

1.3.5 2-氨基-5-（4′-甲基-5′-（苯甲酰胺基）-噻唑-2-基-氨基）-5-羰基戊酸的合成（7） 化合物（6）中加入40%HBr的冰醋酸溶液10 mL，常溫反應2 h，減壓除去HBr和冰醋酸，加入甲醇溶解，減壓濃縮至干，加入少量5%的醋酸溶解，然后用2%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7左右，此時產(chǎn)生大量沉淀，過濾，用水洗滌濾餅（10 mL×3），干燥，甲醇重結晶，得白色固體（7），產(chǎn)率88%。

1.4 生物活性測定

采用菌絲生長速率法［16］測定L-谷氨酸-拌種靈耦合物對水稻紋枯病菌的抑菌活性。以拌種靈原藥為對照，不加藥劑為空白對照，每處理重復3次。制作含系列濃度藥劑的PDA平板，取水稻紋枯病菌菌餅接種于平板中央，28℃條件下培養(yǎng)。采用十字交叉法測量菌落直徑，按照下式計算各處理對菌絲生長的抑制率，根據(jù)濃度對數(shù)與抑制率幾率值，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算藥劑對水稻紋枯病菌的毒力回歸方程、相關系數(shù)以及有效抑制中濃度EC50。

菌絲增長直徑（mm）=菌絲生長直徑-菌餅直徑；抑制率=（空白對照菌絲增長直徑-藥劑處理菌絲增長直徑）×100%（/空白對照菌絲增長直徑）

1.5 供試化合物對煙草植株處理方法

分別稱取0.8 g L-谷氨酸-拌種靈耦合物與拌種靈原藥，用少量0.5 mol/L的HCl溶解，加入3滴吐溫-80，用水稀釋至1 L，得到800 mg/L的藥液，取少量稀釋到200 mg/L的藥液。采用涂葉和水培2種處理方法。涂葉方法：挑選長勢一致的煙草，選擇中部第6、第7片葉用毛筆涂布800 mg/L的藥液，使藥液均勻涂布葉片兩面，處理后于12、24、36、48 h取樣分析處理葉片、頂端生長點、莖和根中供試化合物的含量。水培方法：小心挖取整株煙草，洗凈后置于200 mg/L的藥液中，培養(yǎng)24 h取樣。

1.6 煙草植株樣品前處理方法

參照胡奎等［17］的方法，取藥劑處理煙草植株葉片、頂端生長點（包括1～2片未完全展開的葉片）及藥劑處理葉片附近的莖、植株根部。4部分樣品各取鮮重10 g，洗凈風干粉碎，加入100 mL甲醇超聲波提取10 min，過濾，濾渣繼續(xù)超聲波提取2次，所得提取液濃縮至2 mL。先加入5 mL甲醇沖洗萃取柱，沖洗結束后，將提取液加入到飽和NaCl溶液20 mL中，移至固相萃取柱上，抽濾速度控制在3滴/s，完全轉入后棄去水相，用80%（V/V）甲醇40 mL沖洗萃取柱。萃取液濃縮定容至5 mL，微孔濾膜過濾，待測。

1.7 色譜條件

色譜柱為ODSC18反相鍵合柱（5μm，250 mm×4 mm），柱溫25℃，流動相為甲醇∶水=55∶45（V/V），流速1 mL/min，進樣量20μL，檢測波長270 nm。

1.8 標準溶液配制及標準曲線的繪制

準確稱取供試化合物10.0 mg，用色譜甲醇溶解并定容至20 mL，得到500 mg/L標準品溶液，再稀釋成濃度為50.000 00、25.000 00、12.500 00、6.250 00、3.125 00、1.562 50、0.781 25 mg/L的系列標準溶液，在“1.7”方法條件下測定各標準溶液的吸收峰面積，繪制標準曲線。

1.9 添加回收試驗

分別稱取煙草的葉片、莖和根各10 g，分別加入L-谷氨酸-拌種靈耦合物和拌種靈的標準溶液，添加水平分別為10、5、1μg/g，按照上述方法進行前處理和檢測，平行測定3次，計算回收率與相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 合成化合物的結構表征

以谷氨酸與拌種靈為原料，合成了目標化合物L-谷氨酸-拌種靈耦合物，新化合物結構表征數(shù)據(jù)如下：2-氨基-5-（4′-甲基-5′-（苯甲酰胺基）-噻唑-2-基-氨基）-5-羰基戊酸，分子式為C16H18N4O4S（7），白色固體，m.p.＞260℃。1H-NMR（400 MHz，DCl，D2O）δ：1.89～2.11（m，2H，OOC-C-CH2），2.50（s，3H，CH3-thiazol），2.53～2.66（m，2H，OC-CH2-），3.34～3.39（m，1H，OOC-CH-C），7.05～7.66（m，5H，-C6H5），12.41（s，1H，-COOH）；13C-NMR（400 MHz，DCl，D2O）δ：17.2，21.5，22.4，25.0，26.2，30.5，31.4，51.3，119.0，120.5（2C），123.7，128.6（2C），138.9，151.3，157.2，160.7，170.5，170.7；ESI-MSm/z：725.2［2M+H］+，363［M+H］+，234.0［M-C5H8NO3］+。

2.2 目標化合物的抑菌活性

以水稻紋枯病菌為供試菌種，拌種靈為對照藥劑，對L-谷氨酸-拌種靈耦合物進行室內(nèi)毒力測定。結果表明，L-谷氨酸-拌種靈耦合物一定程度上保留了對水稻紋枯病菌抑制活性，EC50略低于對照藥劑拌種靈。L-谷氨酸-拌種靈耦合物毒力回歸方程為y=1.347 8x+4.058 9，R2=0.996 5，EC50為4.99 mg/L（13.76μmol/L）。拌種靈毒力回歸方程為y=1.599 0x+4.259 2，R2=0.987 6，EC50為2.91 mg/L（12.47μmol/L）。

2.3 分析方法的線性范圍

L-谷氨酸-拌種靈耦合物保留時間為11.89 min；拌種靈保留時間為7.20 min。在0.781 250～50.000 00 mg/L濃度范圍內(nèi)，L-谷氨酸-拌種靈耦合物及拌種靈的質(zhì)量濃度與液相色譜峰面積之間存在較好的線性關系。L-谷氨酸-拌種靈耦合物的質(zhì)量濃度與液相色譜峰面積之間的線性方程為y=7.220 8x-0.088 8，R2=0.999 5；拌種靈質(zhì)量濃度與液相色譜峰面積之間的線性方程為y=132.240x-21.455，R2=0.999 9。從線性方程分析發(fā)現(xiàn)，谷氨酸-拌種靈耦合物的線性方程的斜率與拌種靈相比減小了很多，其原因是在色譜檢測器上的響應值降低了，說明拌種靈的氨基上發(fā)生取代后，改變了拌種靈分子原來的共軛結構，使分子的紫外吸收明顯減弱。

2.4 添加回收率結果

L-谷氨酸-拌種靈耦合物和拌種靈在煙草葉片、莖和根的添加回收率為86.50%～97.93%，相對標準偏差為1.26%～9.54%。各個樣本的添加回收率和相對標準偏差符合殘留分析的要求。

2.5 煙草植株中供試化合物含量的測定結果

拌種靈和L-谷氨酸-拌種靈耦合物處理后不同時間在煙草葉片、頂端生長點、莖和根中的含量如表1所示。從表1可以看出，拌種靈處理煙草葉片后，被處理的葉片中拌種靈的含量在48 h達到峰值，并且頂端生長點內(nèi)拌種靈的含量也逐漸增加，莖中拌種靈的含量變化沒有明顯的規(guī)律，在根部沒有檢測到拌種靈的存在。與拌種靈相比，L-谷氨酸-拌種靈耦合物處理葉片后，處理的葉片中L-谷氨酸-拌種靈耦合物的含量在24 h達到最大值，且在12 h葉內(nèi)含量就迅速達9.45μg/g，36 h又迅速下降至6.20 μg/g，隨后48 h略有下降。與此相對應，在頂端生長點，24 h也達到吸收的最大值，達3.73μg/g，并且在處理初期，生長點L-谷氨酸-拌種靈耦合物的含量明顯高于拌種靈處理的植株。在莖中，L-谷氨酸-拌種靈耦合物的含量在測定的整個階段都在1.00μg/g左右，但在根部，L-谷氨酸-拌種靈耦合物的含量在36 h達到最大值，并且超過莖部的含量，比較可以發(fā)現(xiàn)頂端生長點和根中化合物含量大于莖，表明該化合物能通過植物葉片吸收，經(jīng)韌皮部移動并向生長點積累。利用2種藥劑進行水培處理煙草植株后，24 h取樣分析，發(fā)現(xiàn)拌種靈在植株各部位的含量大小順序為根＞葉片＞莖＞頂端生長點，而L-谷氨酸-拌種靈耦合物在植株各部位的含量大小順序為根＞頂端生長點＞葉片＞莖，并且在頂端生長點中的含量達73.78μg/g。

表1 L-谷氨酸-拌種靈耦合物及拌種靈處理煙草苗后在植株各部位的含量

3 小結與討論

本研究將農(nóng)藥分子與氨基酸進行耦聯(lián)，構建了全新的L-谷氨酸-拌種靈耦合物。結果表明，L-谷氨酸-拌種靈耦合物的抑菌活性與拌種靈相接近。2種化合物都有內(nèi)吸活性，在施藥部位都可以被植物吸收。通過根部水培施藥后24 h可在煙草頂端生長點檢出2種化合物，表明化合物可被根吸收并且向上傳導，同時耦合物的吸收傳導性得到增強，相同處理時間下在煙草各部位檢出含量均大于拌種靈，且頂端生長點的含量高于葉片和莖中的含量，說明拌種靈在谷氨酸的氨基酸官能團介導下，有很強的向植株生長點積累的傾向。于中部葉片施藥時，拌種靈不能傳導到根部。而在12 h根部即可檢出L-谷氨酸-拌種靈耦合物，表明其具有很強的向下傳導能力，是一個良好的雙向傳導化合物。

本試驗成功改善了拌種靈的傳導性，L-谷氨酸-拌種靈耦合物表現(xiàn)出比拌種靈更優(yōu)越的內(nèi)吸傳導性，推測這一過程可能是借助植物體氨基酸轉運載體來實現(xiàn)。同時研究中發(fā)現(xiàn)涂葉處理中L-谷氨酸-拌種靈耦合物在根部48 h測得含量較36 h有所降低，可能是該化合物在植物體內(nèi)發(fā)生降解，分解為拌種靈。若氨基酸-殺菌劑耦合物能借助植物體內(nèi)的氨基酸載體改善其向下傳導性，而在到達植物根部時又能分解釋放出殺菌劑分子，將極大改善植物根部病害難以防治、用藥量大的現(xiàn)狀。引入氨基酸改變農(nóng)藥在植物體內(nèi)的傳導方向，使農(nóng)藥在特定部位積累，這樣就可能在減少農(nóng)藥用量的情況下通過提高農(nóng)藥的靶向性，降低使用成本，提高防治效果。同時，還可以通過增強靶向性減少農(nóng)藥對其他部位的傳導積累，提高農(nóng)藥的安全性，減少對環(huán)境的污染，這將大大緩解農(nóng)藥殘留問題，對農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)具有重要意義。