王儷樺，應澤茜，孫貝貝，湯璐璐，杜偉鋒,*，葛衛(wèi)紅，李昌煜

1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

2.浙江中醫(yī)藥大學 中藥炮制技術研究中心，浙江 杭州 311401

3.浙江中醫(yī)藥大學 中藥飲片有限公司，浙江 杭州 311401

4.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，浙江 杭州 310053

麥麩為禾本科植物小麥Triticum aestivumL.麥粒結構中的外種皮和糊粉層，性平，味甘、淡，具有和中益脾的功效[1]，其主要成分為阿魏酸[2]。《本草蒙荃》中記載“麩制抑酷性，勿傷上膈”的理論，《本草通玄》中也提到“麥麩資本谷氣”，可見麥麩能緩和藥物的燥性，增強療效，除去藥物的不快氣味[3]。蜜麥麩為麥麩與蜂蜜共制后的產物，使用方法同麥麩，經蜜制后作為輔料可增強共制藥物的色澤和療效，是中藥炮制中常用的固體輔料[4]。蜜麩炒法的特色在南方古藥幫中廣泛應用，目前，全國四大藥幫中樟幫與建昌幫均使用蜜麩炮制藥物。蜜麥麩炮制后的飲片能起到更好的矯味賦色作用，更能緩和藥物燥性，增強補脾益氣作用[5-6]，其多用于炮制白術、蒼術、僵蠶、山藥[7-10]等中藥。然而，用傳統(tǒng)方法蜜制麥麩的工藝性極強[6]，而且不同地區(qū)對于蜜麥麩的制備工藝各不相同，主要通過人為對其外觀性狀進行判斷，導致蜜麥麩的質量難以把控，進而影響到蜜麥麩制品的質量。

響應面法是一種整合試驗設計和數學建模的優(yōu)化方法，已廣泛運用于中藥炮制、中藥提取、中藥制劑等工藝的優(yōu)選[11-13]。本研究以蜜麥麩含水量、堆積密度、色度、阿魏酸含量的總評歸一值為考察指標，以物料比例、加熱溫度、加熱時間為考察因素，采用Box-Behnken設計-響應面法對蜜麥麩制備工藝進行優(yōu)化，優(yōu)選出最佳制備工藝，為進一步提高蜜麥麩質量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 高效液相色譜儀，日本Dionex 公司，配有四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、恒溫柱溫箱，變色龍色譜數據工作站；Agilent Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；NT-xs105 電子分析天平，0.01 mg，瑞士Mettler Toledo 公司；DHZT-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；DFD-700電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；C21-SDHCB9E10 SUPOR 電磁爐，浙江紹興蘇泊爾生活電器公司。

1.2 試藥

麥麩（批號20190701）、煉蜜（批號20190701）均由浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司提供，并經浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司錢敏主管中藥師按照《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）檢測為合格產品；阿魏酸對照品，批號110773-201012，購于中國食品藥品檢定研究院，質量分數為99.8%；乙腈為色譜純，美國Tedia 公司；水為娃哈哈純凈水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

根據《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）[14]記載，蜜麥麩制備方法為麩皮與煉蜜（加適量開水稀釋）拌勻，搓散，過篩，干燥至不粘手為度，粉碎，過三號篩。

2.2 蜜麥麩指標檢測

2.2.1 水分的測定 按照《中國藥典》2015年版四部“0832 水分測定法”中“第二法（烘干法）”[15]計算蜜麥麩中含水量。

2.2.2 堆積密度的測定 蜜麥麩性狀為黃褐色皮狀顆粒，質較輕，手摸微有黏性，無霉變、無結塊，味淡具有麥麩特殊香氣，略帶甜蜜香氣。堆積密度按照顆粒質量與顆粒自然堆積所占據的表觀體積之比計算。測定每100 dm3單位體積內蜜麥麩的質量，通過比值計算其堆積密度。

2.2.3 色度的測定[16]

（1）供試品溶液的制備：取蜜麥麩粉末1 g，精密稱定，置具塞離心管中，加95%乙醇20 mL，連續(xù)振搖1 h，離心，吸取濾液5 mL，定容至10 mL，即得供試品溶液。

（2）吸光度（A）測定：蜜麥麩顏色在可見光區(qū)最大吸收波長為597 nm 左右，選擇597 nm 作為檢測波長，測定樣品A值。

2.2.4 阿魏酸含量測定[17-18]

（1）對照品溶液的制備：精密稱取阿魏酸對照品4.43 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配成88.60 μg/mL 的對照品溶液，備用。

（2）供試品溶液的制備：精密稱定樣品粉末5 g，置于150 mL 量瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放至室溫，用甲醇補足減失的質量，濾過，取續(xù)濾液25 mL，揮干溶劑，殘渣加甲醇溶解稀釋并定容至5 mL，即得。

（3）色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～15 min，10%～16%乙腈，體積流量0.8 mL/min；15～25 min，16%乙腈，體積流量0.8 mL/min；25～50 min，16%乙腈，體積流量0.6 mL/min；50～55 min，16%～20%乙腈，體積流量0.6 mL/min；55～60 min，20%～30%乙腈，體積流量0.6 mL/min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長320 nm；進樣量10 μL。

（4）專屬性考察：按“2.2.4（3）”項下色譜條件測定空白甲醇溶液、阿魏酸對照品溶液和蜜麥麩供試品溶液，色譜圖見圖1，結果顯示，各組分分離度好，無干擾。

圖1 空白甲醇(A)、阿魏酸對照品(B)、蜜麥麩供試品(C)的HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrogram of blank methanol(A),ferulic acid reference substance(B)and testing sample of honey wheat bran(C)

（5）線性關系考察：精密量取阿魏酸對照品溶液（108.6 μg/mL）1、2、4、6、8、10 μL，按“2.2.4（3）”項下色譜條件進行，測定峰面積。以對照品濃度為橫坐標（X），各自對應的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程Y＝0.626 8X＋9.687，R2＝0.998 1，表明阿魏酸在10.86～108.60 μg/mL 線性關系良好。

（6）精密度考察：取阿魏酸對照品溶液，按“2.2.4（3）”項下色譜條件，連續(xù)進樣測定對照品6次，記錄峰面積，計算阿魏酸峰面積RSD 值為2.69%，表明實驗儀器精密度良好。

（7）穩(wěn)定性考察：取蜜麥麩供試品溶液，按“2.2.4（3）”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、16、24 h 進樣測定同一供試品溶液峰面積，記錄峰面積，計算阿魏酸峰面積RSD 值為2.80%，表明供試品溶液在0～24 h 的穩(wěn)定性良好。

（8）重復性考察：取同一蜜麥麩樣品6 份，每份5 g，按“2.2.4（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4（3）”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算阿魏酸質量分數RSD 值為4.88%，表明重復性良好。

（9）加樣回收率試驗：取已測定阿魏酸含量的樣品9 份，每份5 g，根據樣品中阿魏酸含量按照高、中、低質量濃度比例分別加入對照品阿魏酸對照品溶液，按“2.2.4（3）”項下色譜條件測定峰面積，計算RSD 值。結果阿魏酸平均回收率為99.21%，其RSD 值為3.50%，結果表明本方法回收率良好。

2.3 蜜麥麩單因素考察

2.3.1 麩皮與煉蜜比例 采用麩皮與煉蜜比例分別為10∶2、10∶3、10∶4、10∶6，拌勻，搓散，過篩，干燥，進行蜜麥麩制備，按“2.2”項下方法檢測所得蜜麥麩水分、堆積密度和色度及阿魏酸含量4 個指標，考察煉蜜用量對試驗中所得蜜麥麩各指標結果的總評歸一值[13]（overall desirability value，OD），利用Hassan 法對各效應值進行歸一化，其歸一值di＝(yi－ymin)/(ymax－ymin)，并對歸一值求幾何平均值，OD＝(d1，d2，…，dn)1/n，本實驗的效應值為綜合指標，綜合指標越高越好。綜合指標為0.351 8、0.652 0、0.515 0、0.163 8。蜜麥麩的綜合指標隨著煉蜜比例的增加呈上升趨勢，在10∶3（30%）到達最高點后下降，故選擇10∶2（20%）、10∶3（30%）、10∶4（40%），因此，選擇這3 個水平進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.3.2 加熱溫度 麩皮與煉蜜比例為10∶3 不變，采用不加熱及80、90、100、120 ℃加熱，加熱時間均為90 s，拌勻，搓散，過篩，進行制備。按“2.2”項下方法檢測所得蜜麥麩水分、堆積密度和色度及阿魏酸含量4 個指標，歸一化后計算綜合評分方法同上，其綜合指標分別為0.084 1、0.462 4、0.548 8、0.325 0、0.163 8。隨著溫度的上升而升高，至90 ℃達到最大后呈下降趨勢，因此選擇80、90、100 ℃ 3個水平進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.3.3 加熱時間 麩皮與煉蜜比例為10∶3 不變，采用90 ℃加熱，加熱時間為70、80、90、100、120 s，拌勻，搓散，過篩，進行制備。測定歸一化綜合指標，其綜合指標分別為0.276 4、0.438 4、0.576 5、0.315 6、0.272 0。綜合指標隨著制備時間的增加而升高，制備時間90 s 達到最高后下降，因此選擇 80、90、100 s 3 水平進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.3.4 炮制用蜜種類 麩皮與煉蜜、生蜜的比例為10∶3 不變，采用90 ℃加熱，加熱時間均為90 s，拌勻，搓散，過篩，進行制備。測定歸一化綜合指標，其綜合指標分別為0.377 3、0.590 0。煉蜜與生蜜對蜜麥麩制備的影響明顯，生蜜制備蜜麥麩不利于過篩，綜合指標比煉蜜制備的蜜麥麩低，因此選用煉蜜進行蜜麥麩制備。

2.3.5 加水量 麩皮與煉蜜比例為10∶3 不變，分別不加開水和加入適量開水（煉蜜與開水比例分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），采用90 ℃加熱，加熱時間為90 s，拌勻，搓散，過篩，進行制備。同上文測定歸一化綜合指標，其綜合指標分別為0.453 5、0.159 0、0.268 8、0.181 2、0.213 5。加水與否對蜜麥麩制備影響明顯，不同比例的加水量對蜜麥麩制備影響差異較大，加水制備蜜麥麩便于拌勻，但水分含量過高，不易于搓散，綜合指標比不加水制備所得蜜麥麩低，因此采用不加水制備。

2.4 Box-Behnken設計-響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 試驗設計 根據Box-Behnken設計-響應面法原理，根據單因素試驗結果，選取麩皮與煉蜜比例（X1）、加熱溫度（X2）、加熱時間（X3）作為因素，每個因素選取3 個水平，以綜合指標為因變量，用Design-Expert 10.0 設計實驗，試驗因素及水平、試驗設計與結果見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計及響應值Table 1 Box-Behnken experiment design and response value

2.4.2 模型擬合與響應面結果分析 響應值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程如下：Y＝0.63－0.015X1－0.033X2＋0.004 577X3－0.071X1X2－0.044X1X3－0.023X2X3－0.092X12－0.13X22－0.068X32，由表2 可知，該模型P＜0.000 1，具有顯著性差異，而失擬項P＝0.278 9＞0.05，無顯著性，說明響應值與預測值之間有較好的擬合度和可信度，因此該模型可用來作為蜜麥麩最佳制備工藝參數的預測模型。根據分析結果，因素中加熱溫度的P＜0.05，具有顯著性差異，說明加熱溫度對蜜麥麩制備工藝具有顯著影響；麩皮與煉蜜比例與加熱溫度的交互效應、麩皮與煉蜜比例與加熱時間的交互效應、麩皮與煉蜜比例二次效應、加熱溫度二次效應、加熱時間二次效應均P＜0.05，說明該因素對蜜麥麩制備工藝具有顯著影響。

表2 方差分析結果Table 2 Analysis result of variance

采用Design Expert 10.0.1 軟件繪制響應值與其中任意2 個因素的交互作用等高線圖（圖2）及響應面3D 曲面圖（圖3）。由等高線圖可知，等高線圖為橢圓形，表明麩皮與煉蜜比例與加熱溫度的交互效應、麩皮與煉蜜比例與加熱時間的交互效應及加熱溫度與加熱時間的交互作用均顯著。由圖3 可知，加熱溫度的曲面變化幅度大于麩皮與煉蜜比例曲面變化幅度；加熱時間的曲面變化幅度與麩皮與煉蜜比例曲面變化幅度差異不大；加熱溫度的曲面變化幅度大于加熱時間曲面變化幅度。因此，所選的各因素水平范圍內，加熱溫度影響對蜜麥麩的制備工藝影響最大。通過求解回歸模型的方程，以綜合指標為評價指標優(yōu)選蜜麥麩的最佳制備工藝為麩皮與煉蜜比例為10∶2.95，加熱溫度為89.88 ℃，加熱時間為90.07 s，此時綜合指標值為0.692 7。

圖2 3 因素之間的交互作用圖Fig.2 Graph of interaction between three factors

圖3 三因素之間的交互作用3D 圖Fig.3 3D Graph of interaction between three factors

2.4.3 最佳工藝驗證 結合試驗情況，調整方案為麩皮與煉蜜比例為10∶3，加熱溫度為90 ℃，加熱時間為90 s，在此條件下進行試驗，測得綜合指標值分別為0.663 7、0.687 2、0.677 2，接近預測值，說明該制備工藝穩(wěn)定、可行。根據該試驗結果，將蜜麥麩制備工藝應用于生產進行驗證，結果顯示該工藝在實際生產中可行、穩(wěn)定。結合實際生產的實用性，使用該制備工藝制備蜜麥麩操作方便，易搓散，過篩，黏性適中。

3 討論

隨著對蜜麥麩使用范圍變大，不同省份對于蜜麥麩的制備工藝各有不同，并且對于蜜麥麩的評價指標只局限于外觀形狀，作為重要的炮制輔料，目前尚無完整的質量標準。本研究根據《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）中蜜麥麩制備工藝，通過單因素考察結果，確定麩皮與煉蜜比例、加熱溫度、加熱時間為影響蜜麥麩制備的3 個因素，由于制備蜜麥麩的過程中，成分變化復雜，與其炮制品產生作用的成分尚不明確，阿魏酸作為麥麩的主要成分之一，本課題組發(fā)現在蜜制過程中其含量會發(fā)生變化[2]，因此選取含水量、堆積密度和色度及阿魏酸含量的總評歸一值作為評價指標，采用 Box-Behnken設計-響應面優(yōu)化試驗對蜜麥麩制備工藝進行優(yōu)化實驗。

在實驗過程中，本課題組發(fā)現在制備蜜麥麩時，由于生蜜黏度較煉蜜低，拌勻耗時長，并且在炮制飲片的過程中，飲片上色時間長且不易上色，還容易導致飲片炮制過度而引起焦片。加水后可便于拌勻，但會使蜜麥麩水分含量過高，在炮制飲片時容易起煙，進而影響飲片的質量，因此本實驗采用煉蜜和不加水的方法制備。通過生產驗證，使用該工藝炮制的蜜麥麩易搓散，黏性適中，證明該工藝在實際生產中穩(wěn)定、可行。

目前，對于蜜麥麩的制備工藝研究較少，主要集中在其炮制飲片的化學成分和藥效學研究[19-21]，蜜麥麩作為一種重要的炮制輔料，其質量的優(yōu)劣直接關系到飲片的臨床藥效，本研究采用實驗室小試的方法，對其最佳工藝進行探索，希望能為蜜麥麩中藥質量控制的標準提供思考。后續(xù)還會繼續(xù)將該工藝運用到炮制飲片及后續(xù)的藥效學研究，將此工藝進一步完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突