佟巖，黃薈，王輝,2，李樹(shù)云，王雨華

(1.植物醫(yī)生研發(fā)中心，資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省野生資源植物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet et Migo)，屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物[1]。我國(guó)民間對(duì)鐵皮石斛的應(yīng)用始于2 000多年前，以新鮮或干燥莖入藥，其干燥莖習(xí)稱“鐵皮楓斗”,是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材[2]。鐵皮石斛富含多糖、生物堿、黃酮類、氨基酸、聯(lián)芐類、芪類及其衍生物、酚類化合物、木質(zhì)素類化合物等次生代謝產(chǎn)物[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明鐵皮石斛對(duì)腸胃病、心腦血管病、糖尿病、腫瘤等都有一定的療效，同時(shí)還具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等功效[4-6]。石斛多糖是鐵皮石斛主要的活性成分和品質(zhì)決定因子，屬水溶性多糖，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是一類由單糖縮合形成的糖苷鍵連接而成的多聚化合物，其含量因品種、發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境等的不同而有差別，水解后產(chǎn)生葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等單糖，這些單糖通過(guò)不同的組合構(gòu)成石斛多糖除了作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貯藏外還參與鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝及其應(yīng)激和防御反應(yīng)，有著復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7-11]。20世紀(jì)以來(lái)，鐵皮石斛益胃生津、滋陰清熱等獨(dú)特的藥用價(jià)值和廣泛的保健效果被全面開(kāi)發(fā)，鐵皮石斛多糖提取液的測(cè)試發(fā)現(xiàn)其可以在皮膚上安全使用，同時(shí)還擁有良好的保濕效果和清除自由基的能力，顯示鐵皮石斛除傳統(tǒng)藥用價(jià)值外在化妝品開(kāi)發(fā)利用中的巨大潛力[12-13]。

野生鐵皮石斛自然分布于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部[1]。多附生于海拔1 600 m以下溫暖濕潤(rùn)、空氣暢通的半陰濕地的樹(shù)木或巖石上，也生長(zhǎng)于開(kāi)闊暴露陽(yáng)光直射強(qiáng)烈的巖層峭壁上，有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性[14]。鐵皮石斛對(duì)光強(qiáng)的適應(yīng)性是和其具有特殊的光合代謝途徑有關(guān)，鐵皮石斛具有兼性景天酸代謝(crassulacean acid metabolism,CAM)植物的特點(diǎn)，其光合碳代謝途徑隨環(huán)境變化可以在CAM途徑和C3途徑間轉(zhuǎn)換[15]。雖然鐵皮石斛具有較強(qiáng)的抗干旱的能力，但它對(duì)冰點(diǎn)以上的低溫極度敏感[16]。鐵皮石斛自然分布區(qū)主要在北緯30°以南地區(qū)，溫度是其分布、生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要限制因子，尤其是低溫造成的冷害、凍害，嚴(yán)重影響其生存、產(chǎn)量和品質(zhì)[17]。因此，研究鐵皮石斛的耐寒性具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)0 ℃低溫處理20 h的鐵皮石斛葉片與20 ℃對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛在冷馴化過(guò)程通過(guò)激活高能量需求的糖水解、氨基酸分解代謝和檸檬酸循環(huán)等途徑來(lái)提高鐵皮石斛的抗寒性，CBF、MAPKKK16蛋白激酶等諸多基因的表達(dá)水平受到顯著影響[18]?？梢?jiàn)，植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)是個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，包括信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的啟動(dòng)以及抗逆相關(guān)代謝反應(yīng)的誘發(fā)等。

植物多糖除了能儲(chǔ)存能源之外還是不可或缺的結(jié)構(gòu)單元，其積累依賴于多種單糖的組裝合成，同時(shí)這些單糖還可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一系列生理活動(dòng)[19]。鐵皮石斛多糖的組成和調(diào)控非常復(fù)雜，目前已對(duì)一些重要的基因有所研究，如：蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是調(diào)控蔗糖合成的關(guān)鍵酶之一，對(duì)光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累有重要影響，其水解產(chǎn)物及衍生物是石斛多糖重要的組成物質(zhì)[20]。類纖維素合成酶基因(cellulose synthase-like,Csl)的CslA亞家族基因參與了鐵皮石斛甘露糖的生物合成，并具有重要作用[21-22]。UDP-阿拉伯吡喃糖變位酶(UDP-arabinopyranose mutase,UAM)是一種吡喃糖-呋喃糖變位酶，參與合成細(xì)胞壁多糖和糖蛋白，對(duì)鐵皮石斛多糖合成尤其是在細(xì)胞壁多糖生物合成過(guò)程中具有重要作用[23]。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)是糖代謝中的關(guān)鍵酶，催化尿苷三磷酸(uridine triphosphate,UTP)+葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)?UDP-葡萄糖(UDPG)+焦磷酸(pyrophosphoric acid，PPi)的可逆反應(yīng)，而UDPG是蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、糖原及其他寡糖和多糖的葡萄糖基供體，參與多糖類物質(zhì)的合成代謝[24-25]。在葉片中，UGPase主要參與蔗糖的合成其催化生成的UDPG提供給SPS(蔗糖磷酸合成酶)或SS(蔗糖合成酶)進(jìn)一步合成蔗糖，此外，UGPase也參與蔗糖的降解、淀粉合成及細(xì)胞壁合成等[26]。另外，在對(duì)靈芝多糖合成及何首烏的研究中還發(fā)現(xiàn)磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)作為碳代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵的分支酶可催化葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-P)和葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)之間的相互可逆轉(zhuǎn)化，在UGPG的作用下生成UDP-葡萄糖從而轉(zhuǎn)化為多糖中的其他單糖組分[27]。UDP-鼠李糖合酶(RHM)則以UDP-Glc為底物連續(xù)催化合成UDP-鼠李糖(UDP-Rha)為進(jìn)一步合成L-鼠李糖及苷提供重要的糖供體，進(jìn)而構(gòu)成鼠李糖多糖參與細(xì)胞壁的形成，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。

本研究選擇了7個(gè)在鐵皮石斛及其他藥用植物多糖研究中經(jīng)驗(yàn)證參與蔗糖、鼠李糖、淀粉、細(xì)胞壁多糖等重要多糖組成物合成途徑中的重要限速酶、合成酶基因。通過(guò)這些基因在鐵皮石斛不同組織和低溫脅迫下不同的表達(dá)模式，探討多糖合成基因?qū)﹁F皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用及低溫脅迫對(duì)多糖合成基因的影響。為解析低溫對(duì)鐵皮石斛多糖合成的影響、鐵皮石斛的抗寒機(jī)制及遺傳改良提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

本實(shí)驗(yàn)用鐵皮石斛采自云南省普洱市石斛種植基地栽種的浙江種源。引至中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所人工氣候室中[晝溫(25±2)℃，夜溫(15±2)℃，光周期為光照12 h/黑暗12 h] 培養(yǎng)4個(gè)月，于2020年4月挑選生長(zhǎng)良好無(wú)病蟲(chóng)害的一年生植株的成熟的根、莖、葉、花4個(gè)組織于-80 ℃液氮中速凍備用。同時(shí)選取10盆長(zhǎng)勢(shì)一致的一年生健康植株，置于低溫(0 ℃)恒溫避光培養(yǎng)箱(Haier)模擬夜間低溫處理，從處理開(kāi)始的0、4、8、12、16、20和24 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取成熟葉組織于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)組織或時(shí)間點(diǎn)樣品選3株取樣品，處理重復(fù)3次。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照張志勇等[25]的方法進(jìn)行改良，使用改良的CTAB-LiCl法提取鐵皮石斛根、莖、葉、花4個(gè)組織及低溫脅迫下7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)葉片樣品的總RNA。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(Tiangen,China)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)參基因篩選

選擇5個(gè)鐵皮石斛中常用的內(nèi)參基因：與蛋白合成和代謝相關(guān)的EF-1α和EF-1β、與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的Actin、與核糖體組成相關(guān)的18S、以及與糖代謝途徑相關(guān)的GAPDH，用于篩選適于本研究的內(nèi)參基因。各引物序列見(jiàn)表1，引物由擎科生物科技有限公司合成。

表1 鐵皮石斛5個(gè)候選內(nèi)參基因qPCR引物

1.4 qRT-PCR分析基因表達(dá)水平

選擇鐵皮石斛多糖合成途徑中7個(gè)與蔗糖、鼠李糖、細(xì)胞壁等多糖合成相關(guān)的基因。從NCBI中搜索鐵皮石斛已有的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋的同源基因序列，用BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)，使用Primer 6.0軟件和Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表2)。

表2 鐵皮石斛多糖合成相關(guān)基因引物信息Tab.2 The related genes primer information of polysaccharide synthesis in D.officinale

以鐵皮石斛根、莖、葉、花4個(gè)不同組織和0 ℃低溫脅迫處理7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的cDNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系(9 μL)為2×Taq Maste Mix 4.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 1.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸5 min，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)150 V 20 min。

用Bio-Rad CFX-96(Bio-Rad laboratories,Hercules,CA,USA) 進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為10 μL：2×SuperReal PreMix Plus(SYBR Green,TIANGEN),cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，1 μL 50×ROX Reference Dye，補(bǔ)充ddH2O至10 μL總體系。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序 95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，70～95 ℃熔解曲線：0.5 ℃,5 s，信號(hào)采集。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

利用Microsoft Excel 2007處理基因的Ct值，使用GraphPad Prism 7作圖。根據(jù)篩選出的內(nèi)參基因，檢測(cè)鐵皮石斛多糖合成相關(guān)基因在4個(gè)不同組織中的表達(dá)差異以及低溫脅迫下的表達(dá)水平變化模式，表達(dá)量計(jì)算使用2-ΔΔCT方法。設(shè)置不同組織間表達(dá)差異以葉片的基因表達(dá)量為1，溫度脅迫處理則以0 ℃、 0 h葉片的基因表達(dá)量為1進(jìn)行對(duì)比，表達(dá)量大于1表示基因上調(diào)，表達(dá)量小于1表示基因下調(diào)。用SPSS 18.0軟件的Student’st-test計(jì)算表達(dá)差異的顯著性(*P<0.05為顯著，**P<0.01為極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA檢測(cè)與候選內(nèi)參基因引物特異性分析

對(duì)提取的鐵皮石斛根、莖、葉、花4個(gè)組織及冷脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)葉片的RNA用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示各組織和冷處理RNA的18S和28S條帶完整無(wú)拖尾，說(shuō)明提取的RNA完整性較好。用Nanodrop ND 2000(DE,USA) 檢測(cè)RNA的濃度，RNA的A260/A280值在1.9～2.1之間，A260/A230值在2.0～2.3之間，表明RNA的純度高，可用于cDNA合成。

用鐵皮石斛避光0 ℃脅迫0 h的葉片cDNA為模板5個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行PCR，2%瓊脂糖檢測(cè)電泳結(jié)果(圖1A)顯示GAPDH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物良好，無(wú)二聚體，且在鐵皮石斛中具有特異性。進(jìn)一步以所有樣品cDNA為模板用GAPDH基因進(jìn)行PCR，產(chǎn)物電泳檢測(cè)(圖1B)顯示GAPDH基因可以在低溫脅迫的各時(shí)間點(diǎn)均可穩(wěn)定良好表達(dá)，此外，GAPDH內(nèi)參基因引物的熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)單一峰表明引物特異性較好，結(jié)果表明在5個(gè)候選內(nèi)參基因中GAPDH基因是最適合于本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物

2.2 7個(gè)多糖合成相關(guān)基因在鐵皮石斛4個(gè)不同組織中的表達(dá)差異分析

采用qRT-PCR方法對(duì)鐵皮石斛根、莖、葉、花4個(gè)不同組織中7個(gè)多糖合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(圖2)，所有基因在鐵皮石斛不同組織中均有表達(dá)，每個(gè)基因的表達(dá)模式各不相同，但共同表現(xiàn)為在花和根中的表達(dá)量均高于在葉片中的表達(dá)量。其中，UAM基因在花和根中有高表達(dá)，是葉和莖的13～18倍。PGM基因在葉、花、根中的表達(dá)量相當(dāng)，在莖中低表達(dá)僅為葉的0.18倍。UGP基因在葉和莖中表達(dá)量相當(dāng)，在花中高表達(dá)是葉中的20倍。CSLA4基因在莖和根的表達(dá)量均比葉高，在花中表達(dá)量更是高達(dá)葉中的59倍。RHM1基因在葉和莖中的表達(dá)量相當(dāng)，在花和根中高表達(dá)，是葉中的9倍(花中)和3倍(根中)。SPS基因在莖和葉中的表達(dá)量相當(dāng)，花和根中的表達(dá)量分別是葉的27倍和9倍。CSLA1基因在花、莖、根中的表達(dá)量均比葉中的高，分別是葉中表達(dá)量的2倍、3倍和5倍，在根中的表達(dá)量最高。

圖2 不同組織中多糖合成相關(guān)基因表達(dá)量的變化熱圖分析Fig.2 Heatmap of the change of seven genes encoding polysaccharide synthesis in four different tissues

2.3 低溫脅迫下7個(gè)鐵皮石斛多糖合成相關(guān)基因的表達(dá)差異分析

本研究以GAPDH為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析7個(gè)鐵皮石斛多糖合成相關(guān)基因在避光0 ℃低溫脅迫下7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示(圖3)，所有基因均表現(xiàn)出在受脅迫后的短時(shí)間(4 h)內(nèi)出現(xiàn)表達(dá)量急劇下調(diào)呈現(xiàn)先受到抑制的現(xiàn)象，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)不同基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。在低溫脅迫的24 h中PGM基因表現(xiàn)出受到持續(xù)的顯著抑制作用。UAM基因呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的波動(dòng)變化，在20 h時(shí)表達(dá)量最高為0 h的1.3倍。UGP基因在短時(shí)間的下調(diào)后在8～20 h期間上升至與0 h相當(dāng)水平到24 h顯著下調(diào)為0 h的0.1倍。CSLA4基因則在12 h時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)為0 h的4.1倍，隨后又逐漸下降。RHM1基因在4～20 h一直處于低表達(dá)量水平到24 h上調(diào)至0 h的1.7倍。SPS基因在4～20 h之間一直處于被抑制表達(dá)到24 h恢復(fù)至0 h表達(dá)量水平。CSLA1基因在12 h時(shí)表達(dá)量升高至0 h的2倍，隨脅迫時(shí)間增加而降低，至20～24 h表達(dá)量均高于0 h。

圖3 低溫脅迫對(duì)鐵皮石斛多糖合成途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 qRT-PCR analysis on the expression patterns of genes in polysaccharide synthesis under low temperature treatment

3 討論與結(jié)論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平分析研究中，但其結(jié)果受RNA質(zhì)量、引物特異性、內(nèi)參基因穩(wěn)定性等多種因素的影響。其中，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性是qRT-PCR結(jié)果準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的保障。雖然科研工作者一直致力于尋找一種或幾種在所有生理狀態(tài)下的細(xì)胞和樣品類型中均能較穩(wěn)定地表達(dá)的理想內(nèi)參基因。但遺憾的是近年來(lái)的大量研究表明，并沒(méi)有表達(dá)絕對(duì)穩(wěn)定的基因，任何一種看家基因的所謂恒定表達(dá)都只是在一定類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下的穩(wěn)定，因此，根據(jù)不同物種、樣品材料和實(shí)驗(yàn)條件篩選合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。在鐵皮石斛物種中Actin、EF-1α、18S、GAPDH、EF-1β基因在前人的研究中都曾根據(jù)自身研究?jī)?nèi)容而選擇作為內(nèi)參基因[29-30]。本研究結(jié)果表明與糖代謝途徑相關(guān)的GAPDH基因在鐵皮石斛根、莖、葉、花4個(gè)不同組織及低溫脅迫葉片中表達(dá)水平穩(wěn)定性較高，更適合作為內(nèi)參基因用于本研究中多糖合成相關(guān)基因在鐵皮石斛不同組織中和低溫脅迫處理下基因表達(dá)的差異分析。

在鐵皮石斛中，UAM、PGM、UGP、CSLA、RHM和SPS與多糖合成相關(guān)的基因在生長(zhǎng)發(fā)育旺盛的花和根組織中的表達(dá)量均高于在成熟的葉和莖組織中的表達(dá)量，表明這些基因均參與了鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。尤其是UGP、CSLA4和SPS基因，其在根和花組織中的表達(dá)量分別是葉組織中的20、59、27倍和6、8、10倍，表達(dá)量差異揭示這3個(gè)基因在鐵皮石斛花和根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。CSLA基因參與合成的甘露聚糖是細(xì)胞壁的構(gòu)成和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程所需的重要物質(zhì)[21-22]。而UGP和SPS基因參與合成的蔗糖則主要為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供碳架和能量，在許多植物的成花轉(zhuǎn)變和花器官發(fā)育過(guò)程中都起著及其重要的作用[31-32]。另外，本研究中的PGM基因經(jīng)比對(duì)鑒定為質(zhì)體型PGM基因，是參與淀粉合成的關(guān)鍵酶基因之一，其在根和花中的表達(dá)量與葉中相當(dāng)，但在莖中表現(xiàn)為顯著低表達(dá)。質(zhì)體型PGM在菠菜(Spinaciaoleracea)[33]和擬南芥(Arabidopsisthaliana)[34]中被發(fā)現(xiàn)定位于葉片的葉綠體中，對(duì)過(guò)渡淀粉的合成至關(guān)重要。He等[21]對(duì)鐵皮石斛莖中的水溶性多糖組成和淀粉含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛莖中的淀粉含量很少(不到10%)，石斛多糖主要為非淀粉多糖，以水溶性多糖為主。

在低溫處理的24 h中，鐵皮石斛葉片中質(zhì)體型PGM基因一直呈顯著下調(diào)表達(dá)，基因表達(dá)受到顯著抑制。在高等植物中，磷酸葡萄糖變位酶(PGM)分為質(zhì)體型PGM(pPGM)和胞質(zhì)型PGM(cPGM)，分別定位在葉綠體上和細(xì)胞質(zhì)中，其質(zhì)體型PGM(pPGM)對(duì)Glc-1-P的形成至關(guān)重要，是淀粉形成的重要酶[34]。低溫處理下鐵皮石斛RHM基因和SPS基因在脅迫前20 h一直呈顯著下調(diào)，表達(dá)受抑制，直至24 h才上調(diào)恢復(fù)至與0 h對(duì)照表達(dá)相當(dāng)水平。RHM是鼠李糖合成的關(guān)鍵酶，并通過(guò)糖苷鍵將活化的鼠李糖與小分子連接起來(lái)構(gòu)成鼠李糖多糖參與細(xì)胞壁的形成及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[35]。蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性反映蔗糖生物合成途徑的能力，與蔗糖的形成呈正相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)SPS基因的表達(dá)受光周期調(diào)控影響，黑暗處理會(huì)抑制SPS基因的表達(dá)，而低溫脅迫會(huì)上調(diào)SPS基因的表達(dá)[36-37]。鐵皮石斛葉片UGP、UAM和CSLA基因在脅迫處理下則呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)表達(dá)的波動(dòng)。已有研究表明鐵皮石斛多糖的積累受晝夜溫差變化影響，晝夜溫差10 ℃(25/15 ℃)是最適促進(jìn)多糖積累的溫度，夜間溫度過(guò)低(25/10 ℃)晝夜溫差(15 ℃)大會(huì)呈現(xiàn)隨處理時(shí)間增加呈先增加后下降的趨勢(shì)[38]。而夜間12 ℃可能是薄皮甜瓜(CucumismeloL.)糖代謝發(fā)生改變的臨界低溫，到夜間9 ℃則嚴(yán)重影響其糖積累及代謝中的相關(guān)酶活性[39]。

綜上所述，GAPDH基因可作為內(nèi)參基因用于鐵皮石斛不同組織及低溫脅迫基因表達(dá)水平研究中。7個(gè)與多糖合成相關(guān)的基因在鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育中也起到一定的調(diào)控作用。而夜間0 ℃低溫對(duì)鐵皮石斛多糖合成相關(guān)基因的表達(dá)有顯著的影響。這些研究結(jié)果為研究低溫對(duì)鐵皮石斛多糖合成的影響、解析鐵皮石斛抗寒機(jī)制及其種質(zhì)資源的改良提供科學(xué)依據(jù)。