任曉斌， 衛(wèi)燕紅， 楊官娥， 王海賓， 薛海龍， 白紅娟

(1. 中北大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院， 山西 太原 030051； 2. 山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 山西 太原 030001；3. 華晉瑞?？萍加邢薰荆?山西 太原 030002)

0 引言

由于采礦、 工業(yè)三廢排放、 城市生活垃圾堆放等眾多原因， 農(nóng)業(yè)土壤的鉻污染日益嚴(yán)重[1]. 鉻在土壤中主要以三價Cr(III)和六價Cr(VI)兩種價態(tài)存在， 微量的Cr(III)是生命體所必需的元素， 且它在環(huán)境中不易發(fā)生遷移， 生物利用度低； Cr(VI)以鉻的陰離子存在， 具有較高的積累性和生物遷移性， 容易被植物吸收富集， 過量的鉻積累會使植物鉻含量超標(biāo)， 影響植物生長， 甚至通過食物鏈危害人體健康； 同時， Cr(VI)的毒性是Cr(III) 的100倍， 且可能對生命體產(chǎn)生致癌、 致異和致畸等作用[2]. 因此， 如何治理六價鉻污染的蔬菜田和減少鉻向蔬菜中遷移再分配， 保障蔬菜安全生產(chǎn)， 已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)之一.

目前， 針對六價鉻污染土壤的修復(fù)思路主要是通過改變鉻在土壤中的存在形式， 將Cr(VI)還原成Cr(III)， 降低鉻在環(huán)境中的遷移能力和生物可利用性. 微生物修復(fù)是一種環(huán)境友好的治理技術(shù)， 具有較好的發(fā)展前景. 國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道脫硫弧菌(Desulfovibriovulgaris)[3]、 芽孢桿菌(Bacillussp.)[4]和草酸青霉(Penicilliumoxalicum)SL2[5]等菌株通過將Cr(VI)還原成Cr(III)來修復(fù)污染的土壤. 光合細(xì)菌是具有原始光能合成體系的原核生物， 能在厭氧光照條件下進(jìn)行不放氧光合作用， 特別是光合細(xì)菌中的紫色非硫細(xì)菌， 具有隨著生存環(huán)境而靈活改變代謝類型的特性， 同時也是益生菌[6]. 范文宏等[7-8]利用光合細(xì)菌球形紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides修復(fù)鎘或鉛污染的土壤， 經(jīng)該菌株修復(fù)后的土壤種植小麥， Cd和Pb在小麥根和葉中的積累都有所減少. 本課題組[9-11]研究結(jié)果表明， 光合細(xì)菌球形紅細(xì)菌RhodobactersphaeroidesH菌株能明顯改變土壤中Cd和Pb的賦存形態(tài)， 同時改善污染土壤中微生物群落DNA序列的多樣性， 減少蔬菜中Pb和Cd的累積， 提高農(nóng)作物品質(zhì). 前期研究工作表明， 光合細(xì)菌H菌株能有效還原水中Cr(VI)， 其機(jī)制包括生物還原和積累[12]. 基于此， 本文利用H菌株對鉻污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)， 并以小白菜為供試材料， 通過盆栽試驗(yàn)研究光合細(xì)菌對鉻污染土壤中小白菜生長及鉻積累的影響， 以期為光合細(xì)菌修復(fù)鉻污染土壤及其安全利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：光合細(xì)菌H菌株系紫色非硫菌群紅細(xì)菌屬的球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)， 由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室惠贈[13].

培養(yǎng)基： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基[13].

試劑： 濃硝酸、 高氯酸均為優(yōu)級純， 其余所用試劑均為分析純.

儀器： 紫外-可見分光光度計(jì)(8000S型)， 雷磁pH計(jì)(PHS-3C型)， 光照培養(yǎng)箱(GXZ-260A型)， 超凈工作臺(SW-CJ-1F型)， 水浴恒溫振蕩器(WE-2型)， 高速離心機(jī)(HC-3018型)， 人工氣候箱(MGC-400H型)， 不銹鋼電熱板(DB-3型)， 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(iCAP 7000型).

供試小白菜品種為四季小白菜， 在2019年6月 10日播種， 2019年7月20日收獲.

1.2 土壤樣品的采集、 處理

土樣取自山西省太原市尖草坪區(qū)上蘭村， 深0 cm～20 cm， 基本性質(zhì)見表1， 取回實(shí)驗(yàn)室后去除雜質(zhì)， 過2 mm尼龍篩， 利用K2Cr2O7配制成4種不同濃度鉻(25 mg·kg-1, 50 mg·kg-1, 75 mg·kg-1和100 mg·kg-1)的土壤， 平衡30 d， 滅菌， 備用.

表1 供試土壤基本性質(zhì)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

光合細(xì)菌對鉻污染土壤的生物修復(fù)：光合細(xì)菌和鉻濃度分別用R，C表示， 實(shí)驗(yàn)設(shè)5個鉻污染濃度， 分別為C0(0 mg·kg-1)，C1(25 mg·kg-1)，C2(50 mg·kg-1)，C3(75 mg·kg-1)，C4(100 mg·kg-1)， 在所設(shè)的每個鉻濃度下， 再設(shè)4個菌劑接種量， 分別為R0(不加光合細(xì)菌)，R1(107個/克土)，R2(108個/克土)，R3(109個/克土)， 以R0作為對照， 組成20個實(shí)驗(yàn)組. 將培養(yǎng)好的帶有菌體的液體培養(yǎng)基按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依次加入到土壤中， 混合均勻， 用保鮮膜對每個花盆封口， 保證光合細(xì)菌所需的厭氧環(huán)境， 每盆中的土壤質(zhì)量為1.5 kg， 將各處理組置于30 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)， 并保持田間持水量的60%， 培養(yǎng)一個月.

小白菜盆栽實(shí)驗(yàn)：選取飽滿、 大小一致的小白菜種子浸種、 催芽后均勻種植于上述花盆中， 每盆定植5棵白菜， 每組3個平行， 并保持田間持水量的60%， 隨機(jī)置于室內(nèi)自然光下生長， 40天后收獲小白菜， 先用自來水將植株沖洗干凈， 最后用去離子水潤洗， 吸干表面水分， 分成地上部分和地下部分， 保存， 待測.

1.4 測定項(xiàng)目及方法

小白菜的株高和根長： 收獲小白菜后， 用自來水清洗植株和根部， 測量3次株高和根長， 并取平均值.

植物中葉綠素含量的測定采用丙酮浸提法[14].

植物中可溶性糖含量的測定采用苯酚硫酸法[15].

植株中鉻含量的測定：收獲植株的根、 莖、 葉于105 ℃下殺青0.5 h， 75 ℃烘干至恒重， 稱取適量的地上部分和根系干質(zhì)量， 用配比為HNO3∶HClO4=4∶1的消解液進(jìn)行消解， 消解液中鉻含量采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定. 采用轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)表示鉻在小白菜各部位中的遷移特性， 轉(zhuǎn)移系數(shù)計(jì)算公式為

TF=植株地上部分的鉻含量(mg·kg-1)/

植株根系的鉻含量(mg·kg-1).

土壤中鉻的五種形態(tài)提取方法及測定：稱取部分烘干土樣， 采用Tessier連續(xù)提取法[16]， 分別提取可交換態(tài)、 碳酸鹽結(jié)合態(tài)、 鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)、 有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)、 殘?jiān)鼞B(tài)， 土壤樣品用HNO3-HCl-HClO4電熱板消解， 采用ICP-OES進(jìn)行鉻含量的測定.

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和Origin8.5軟件分析與作圖， 并運(yùn)用SPSS22.0軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 光合細(xì)菌對不同濃度鉻污染土壤中小白菜株高和根長的影響

圖1 和圖2 分別是不同處理組對小白菜株高和根長的影響.

圖1 不同處理組對小白菜株高的影響

圖2 不同處理組對小白菜根長的影響

由圖1 和圖2 可以看出， 在加入光合細(xì)菌之前， 小白菜的株高和根長隨著鉻濃度的增加而減小， 說明鉻濃度對株高和根長的影響是顯著的(P<0.05). 在同一鉻濃度條件下， 與對照組相比， 隨著光合細(xì)菌量的升高， 小白菜的株高和根長均有所增加， 且在加菌量為108個/克土?xí)r， 效果較好， 此時與加菌前相比，C0～C4處理組的株高分別增加了9.09%， 4.71%， 8.97%， 7.35%和6.45%， 根長分別增加了6.25%， 4.6%， 5.13%， 4.05%和5.8%， 可見光合細(xì)菌量對株高和根長的影響也是顯著的(P<0.05).

2.2 光合細(xì)菌對不同濃度鉻污染土壤中小白菜葉綠素含量的影響

圖3 是光合細(xì)菌對不同濃度鉻污染土壤中小白菜葉綠素含量的影響. 圖中， 同一柱形， 字母不同表示差異顯著(P<0.05). 后續(xù)各圖均同.

圖3 光合細(xì)菌對不同濃度鉻污染土壤中小白菜葉綠素含量的影響

由圖3 可知， 無論加菌與否， 植株中的葉綠素含量隨著鉻濃度的增加而顯著減少(P<0.05)， 尤其在鉻濃度大于50 mg·kg-1時， 下降趨勢更加明顯. 加入光合細(xì)菌處理后， 與對照組相比， 各金屬鉻濃度下植株的葉綠素含量均顯著增加(P<0.05)， 且在施加量為108個/克土?xí)r， 葉綠素含量最多， 分別升高了20.89%， 13.78%， 12.30%， 15.29%和14.19%.

2.3 光合細(xì)菌對不同濃度鉻污染土壤中小白菜可溶性糖含量的影響

光合細(xì)菌量也會對小白菜的可溶性糖含量產(chǎn)生一定的影響(圖4)， 與對照組相比， 相同鉻濃度條件下， 隨著光合細(xì)菌量的增加， 植株的可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)， 并且在加菌量為108個/克土?xí)r可溶性糖含量最多， 比對照組分別升高了15.93%， 13.45%， 11.75%， 10.07%和13.69%， 可見光合細(xì)菌有利于植物的可溶性糖含量升高， 對植物的生長有積極作用.

圖4 光合細(xì)菌對不同濃度鉻污染土壤中小白菜可溶性糖含量的影響

2.4 光合細(xì)菌對植株鉻含量的影響

表2 是光合細(xì)菌對小白菜各組織Cr含量的影響.

表2 光合細(xì)菌對小白菜各組織鉻含量的影響

從表2 中可以看出， 各實(shí)驗(yàn)組和對照組中根的Cr濃度均遠(yuǎn)高于莖、 葉， 說明Cr主要在根中積累. 而且， 在相同鉻濃度條件下， 隨著光合細(xì)菌量的增加， 植株的地上部分和根系的鉻含量都在減少， 說明光合細(xì)菌量與植株的地上部分和根系的鉻含量具有顯著相關(guān)性(P<0.05)， 相應(yīng)的轉(zhuǎn)移系數(shù)也在下降， 并且最適加菌量為108個/克土， 此時與對照組相比，C1(25 mg·kg-1)處理組中地上部分和根系分別降低了 33.32% 和 18.46%，C2(50 mg·kg-1)處理組中地上部分和根系分別降低了19.83%和8.44%，C3(75 mg·kg-1)處理中組地上部分和根系分別降低了15.18%和8.28%，C4(100 mg·kg-1)處理組地上部分和根系分別降低了15.05%和5.61%. 由此可見， 光合細(xì)菌對鉻的植物利用度有明顯的降低作用.

2.5 光合細(xì)菌對土壤中鉻的形態(tài)的影響

為了了解鉻在生物修復(fù)前后的形態(tài)變化， 測定了試驗(yàn)組(C1R2，C2R2，C3R2，C4R2)和對照組(C1R0，C2R0，C3R0，C4R0)中鉻的五種形態(tài)含量， 由圖5 可知， 加入光合細(xì)菌前， 土壤中鉻的形態(tài)主要以殘?jiān)鼞B(tài)和可交換態(tài)為主， 經(jīng)光合細(xì)菌修復(fù)后， 殘?jiān)鼞B(tài)含量、 有機(jī)結(jié)合態(tài)和鐵錳氧化態(tài)含量增加， 碳酸鹽結(jié)合態(tài)和可交換態(tài)含量減少.

圖5 光合細(xì)菌對土壤中鉻的形態(tài)的影響(左：對照; 右：加菌)

與對照組相比，C1～C4處理組中鉻的殘?jiān)鼞B(tài)分別增加了37.64%， 25.69%， 32.52%和22.85%； 有機(jī)結(jié)合態(tài)分別增加了 21.92%， 30.51%， 39.90%和35.34%； 鐵錳氧化態(tài)分別增加了30.51%， 30.68%， 23.22%和25.29%； 碳酸鹽結(jié)合態(tài)分別降低了44.42%， 29.00%， 28.32% 和20.49%； 可交換態(tài)分別降低了 48.14%， 24.80%， 16.01%和40.22%， 使得殘?jiān)鼞B(tài)和有機(jī)結(jié)合態(tài)成為主要相.

3 討 論

本研究試驗(yàn)結(jié)果表明, 鉻對小白菜的生長有一定的抑制作用. 也有研究發(fā)現(xiàn)， 重金屬脅迫會造成植物抗氧化酶系統(tǒng)紊亂、 打破植物體內(nèi)金屬離子平衡系統(tǒng)， 抑制其光合作用和生長[17-18]， 為了降低重金屬污染對植物生長的不利影響， 在土壤中接種微生物或者重金屬鈍化菌劑， 提高植物對重金屬的耐受性， 成為當(dāng)前重金屬生物修復(fù)的研究熱點(diǎn). 熊智慧等[19]通過接種Alcaligenessp. qz-1改善了鉻脅迫下玉米生長特性, 降低了鉻對玉米的毒害. Debiec等[20]通過砷氧化細(xì)菌對砷污染土壤進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)， 結(jié)果表明， 菌株在土壤中的存在促進(jìn)了植株的生長.

重金屬還會通過抑制植物體內(nèi)某些酶的合成， 降低其葉綠素和可溶性糖含量. 簡敏菲等[21]研究了重金屬鎘、 鉛脅迫下濕地植物丁香蓼的生理生化特征， 結(jié)果表明：丁香蓼葉片的葉綠素a、 b的含量均隨著重金屬污染物脅迫濃度的增加而呈下降趨勢. 在土壤中接種微生物， 則有助于緩解重金屬脅迫對植物葉綠素和可溶性糖含量的不利影響. 劉玉玲等[22]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， Cd脅迫下添加Delftia sp. B9菌液能顯著增加水稻幼苗的葉綠素和可溶性糖含量. 本研究中， 在土壤中接種光合細(xì)菌不僅可以有效增加鉻脅迫下小白菜的株高和根長， 還可以提高小白菜葉片葉綠素和可溶性糖含量， 表現(xiàn)出良好的促生能力. 這主要是因?yàn)楣夂霞?xì)菌對Cr(VI)具有一定的生物還原作用[12]， 土壤中的部分Cr (VI)被有效還原為Cr(III)， 改變了土壤中鉻的生物有效性， 減弱了根系對鉻的吸收； 另一方面， Cr(III)的毒性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Cr(VI)， 能夠?yàn)橥寥乐形⑸锾峁┝己玫纳姝h(huán)境， 促進(jìn)有益微生物繁殖， 加快土壤中有機(jī)質(zhì)分解[2]， 從而增強(qiáng)了合成葉綠素有關(guān)酶的活性, 提高了葉綠素和可溶性糖含量， 促進(jìn)了植株的生長. 同時， 光合細(xì)菌接種量為108個/克土?xí)r， 小白菜的葉綠素和可溶性糖含量最多， 生長得最好， 接種量大于108個/克土?xí)r， 效果會有所下降， 這主要是因?yàn)樵谝欢ǖ目臻g、 有限的資源內(nèi)， 存在一個最適接種量， 接種量過多會加劇微生物之間的競爭， 導(dǎo)致部分微生物死亡， 同時也可能是光合細(xì)菌靠植物供給部分營養(yǎng)， 若接種量過多將大量消耗植物營養(yǎng)， 影響植株生長， 從而出現(xiàn)下降的趨勢[23].

研究還發(fā)現(xiàn)， 微生物在促進(jìn)植物生長的同時, 也可以影響植物對重金屬的吸收利用， 這在相關(guān)文獻(xiàn)中也有報(bào)道， 如Gordeeva等通過研究發(fā)現(xiàn)， 在砷污染土壤中加入固氮菌和芽孢桿菌后， 顯著影響了根際土壤中砷的流動性， 有助于砷在土壤中的固定， 阻止其進(jìn)入植物細(xì)胞[24]. 重金屬的毒性和生物利用度主要取決于其形態(tài)， 而不是總濃度[25]. 據(jù)報(bào)道， 可交換相和與碳酸鹽結(jié)合相很容易被植物根系吸收， 殘余相是很難被利用的[26-27]. 因此， 金屬形態(tài)的變化， 特別是可交換態(tài)的變化， 會直接影響重金屬的生物有效性， 進(jìn)而影響修復(fù)效率. 范文宏教授課題組[7-8]利用光合細(xì)菌對Pb、 Cd的生物修復(fù)結(jié)果表明， 光合細(xì)菌可以顯著減少Pb、 Cd的可交換態(tài)， 更多地將可利用組分轉(zhuǎn)化為不易獲得的惰性組分， 鉛、 鎘污染土壤的修復(fù)機(jī)制主要是硫化鉛、 硫酸鉛和硫化鎘等惰性化合物的沉淀形成降低了重金屬的生物有效性. 另外， 金屬價態(tài)的變化也會影響重金屬的生物有效性， Goulhen等[3]在高濃度Cr(VI)環(huán)境中生長的脫硫弧菌細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了還原形式的Cr(III)沉淀， 說明脫硫弧菌對Cr(VI)具有一定的還原作用； 葉斌暉等[5]研究發(fā)現(xiàn)， 在草酸青霉SL2對鉻污染土壤的生物淋洗過程中， 泥漿中Cr(VI)濃度迅速降低， TCr的含量不斷升高， 而Cr元素在環(huán)境中一般以三價和六價為穩(wěn)定價態(tài)， 可知其中的Cr(VI)應(yīng)是被還原為Cr(III). 體系中Cr(VI)的充分還原可顯著降低其生物毒性及遷移性[28]， 在本研究中， 通過光合細(xì)菌對鉻污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 土壤中鉻的五種形態(tài)含量發(fā)生明顯變化， 碳酸鹽結(jié)合態(tài)和可交換態(tài)含量減少， 殘?jiān)鼞B(tài)含量、 有機(jī)結(jié)合態(tài)和鐵錳氧化態(tài)含量增加. 由于可交換相較其他形態(tài)更容易釋放， 可以解釋在此過程中鉻的可交換性相明顯減少. 碳酸鹽結(jié)合態(tài)在土壤中屬于易溶解相[29]， 而光合細(xì)菌可以提高土壤中某些酶的活性， 進(jìn)而促進(jìn)碳酸鹽結(jié)合態(tài)的溶解. 此外， 光合細(xì)菌能有效還原鉻(VI)[12]， 而還原后的Cr(III)可能以Cr(OH)3或CrPO4的形式固定在細(xì)胞表面[30]， 使得殘?jiān)鼞B(tài)含量增加； 鐵錳氧化態(tài)和有機(jī)結(jié)合態(tài)容易與還原后的部分Cr(III) 發(fā)生絡(luò)合作用[29]， 使得兩種組分的含量增加， 最終改變了土壤中鉻的形態(tài)含量分布， 由此降低了重金屬的生物利用度和土壤的毒性， 這也是小白菜對土壤中鉻的吸收和積累減少的原因.

4 結(jié) 論

1) 接種光合細(xì)菌可以促進(jìn)鉻脅迫下小白菜植株的生長， 有效增加小白菜的株高和根長， 提高葉片的葉綠素和可溶性糖含量， 且在加菌量為108個/克土?xí)r效果最好； 同時接種光合細(xì)菌也降低了小白菜植株地上部和根系的鉻含量， 且鉻含量主要積累于根部.

2) 光合細(xì)菌會促進(jìn)鉻污染土壤中鉻的形態(tài)由碳酸鹽結(jié)合態(tài)、 可交換態(tài)向穩(wěn)定的鐵錳氧化態(tài)、 有機(jī)結(jié)合態(tài)與殘?jiān)鼞B(tài)轉(zhuǎn)化， 由此降低重金屬鉻的生物利用度和遷移率， 表現(xiàn)出光合細(xì)菌對鉻污染土壤良好的修復(fù)作用.