仁紹坤 陸應(yīng)彩

小曲清香型是云南生產(chǎn)的白酒香型代表，這是一種以糧谷為主要釀造原料，以小曲或純種根霉為糖化發(fā)酵劑，采用傳統(tǒng)的固態(tài)法生產(chǎn)，不添加任何呈香呈味呈色物質(zhì)的白酒。好的小曲清香型白酒要經(jīng)過糖化發(fā)酵、蒸煮培菌等極其復雜特殊的釀造工藝，唯有如此，酒體才會呈現(xiàn)甘醇的口感。而很多沒錢、沒技術(shù)、沒好原料的小作坊、小企業(yè)，為了達到這種甘醇的口感，就在制造過程中非法添加一些添加劑，比如甜味劑、增香劑等來達到良好的香氣和口感。我國在《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》GB2760-2014中明確規(guī)定了甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜等甜味劑的適用范圍及添加限量，而純白酒中不得使用甜味劑。

對于食品中甜味劑的檢測，國家標準涉及的大多是色譜法，比如高效液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法，存在檢出限高、只能單一檢測一種或兩種甜味劑、多種甜味劑同時檢測分離效果不佳等問題。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有定性結(jié)果可靠、靈敏度高、能同時快速測定多種物質(zhì)的特點，成為甜味劑檢測領(lǐng)域的研究熱點。近年來也有許多關(guān)于液質(zhì)聯(lián)用法同時檢測白酒中多種甜味劑的方法研究，《白酒中四種甜味劑的測定-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》DB34/T2498-2015和《白酒中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜和三氯蔗糖四種甜味劑的測定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》DBS52/007-2014這兩個地方標準都采用液質(zhì)聯(lián)用法來檢測白酒中的甜味劑，但只包含了4種甜味劑，種類較少，而其他的方法又存在一定的弊端，如前處理較繁瑣、流動相復雜、靈敏度偏低、檢出限和定量限較高、耗時長等。因此，本研究的目的就是要建立一種快捷、準確、靈敏度好、精密度高、可同時檢測云南小曲清香型白酒中多種甜味劑的液質(zhì)聯(lián)用方法。

一、材料與儀器

1.樣品。成品酒，取自于云南西雙版納傣族自治州景洪市、勐海縣、勐臘縣市售小曲清香白酒。

2.試劑。甲醇（色譜純），美國Fisher公司；甲酸（色譜級），Aladdin；實驗室用水，屈臣氏超純水。

3.標準品。安賽蜜（液體，100171，1mg/mL，純度>99.0%），北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司；糖精鈉（液體，19001，1mg/ml，純度>99.0%），中國計量科學研究院；甜蜜素（固體，G855226，純度99.9%），Dr.Ehrenstorfer公司；三氯蔗糖（固體，2000μg/ml，S047521，純度99.9%），天津阿爾塔科技有限公司；阿斯巴甜（固體，128464，純度≥97.7%），Dr.Ehrenstorfer公司；阿力甜（液體，70480，純度≥99.8%），TMstandard；愛德萬甜（固體，ALT702308，純度>99.0%），天津阿爾塔科技有限公司；紐甜（液體，2008087，1000μg/mL，壇墨質(zhì)檢國家標準物質(zhì)中心；甜菊糖苷（液體，S057199，1000μg/mL），天津阿爾塔科技有限公司。甲酸水溶液（0.1%）：準確移取0.1mL甲酸置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。

4.儀器。Agilent高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，安捷倫科技有限公司，Agilent1290InfinityⅡ/6470LC/TQ；萬分之一天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，SI-224；水浴鍋HH-6，常州國華電器有限公司；有機濾膜，孔徑0.22μm，天津津滕實驗設(shè)備有限公司。

二、實驗與方法

1.標準溶液制備。（1）標準儲備液。稱取阿斯巴甜（固態(tài)）、甜蜜素（固態(tài)）、糖精鈉（固態(tài)）、愛德萬甜（固態(tài)）標準品各0.010g，置于10mL容量瓶中并用純水定容，制成1mg/mL的標準儲備液。安賽蜜、三氯蔗糖、阿力甜、紐甜、甜菊糖苷均為1mg/mL的標準液。（2）標準使用液。取上述1mg/mL標準儲備液1mL，用水定容至100mL，配置成10000μg/L的標準使用液。再用純水稀釋成濃度分別為5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L的混合標準曲線系列，過0.22μm濾膜，依據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

2.白酒樣品預處理。用燒杯稱取樣品約10g（精確至0.01g），置60℃恒溫水浴，直至乙醇除凈。再移入50mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，依據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

3.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件。（1）液相色譜條件。色譜柱：oroshell120EC-C18（2.1mm*100mm，1.9μm）；進樣量：5μL；流動相：A：甲酸水溶液（0.1%），B：甲醇；流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；采用梯度洗脫：0.0-0.5min，A：95%，B：5%；0.5-3.0min，A：95%-10%，B：5%-90%；3.0-6.5min，A：10%，B：90%；6.5-7.5min，A：10%-95%，B：90%-5%；7.5-8.0min，A：95%，B：5%。（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離ESI（-）ESI（+）；毛細管電壓：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛細管反吹干燥氣溫度：280℃；毛細管反吹干燥氣流量：9L/min；霧化器壓力：40psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L/min；噴嘴電壓：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式MRM；駐留時間：40ms。

三、結(jié)果與分析

1.樣品前處理的優(yōu)化。白酒樣品中含有的乙醇會對檢驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，采用濾膜過濾、離心、加水稀釋的方法并不能完全消除乙醇的影響，采用氮吹或是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法對儀器的要求相對較高，耗時也比較長。本研究選擇把樣品于60℃水浴加熱來除去乙醇，可以有效減弱乙醇基質(zhì)干擾，降低乙醇對色譜峰峰型的影響，提高檢測方法的準確性與重現(xiàn)性。

2.質(zhì)譜條件的選擇。將一定質(zhì)量濃度的標準品連續(xù)注入質(zhì)譜，在ESI負離子/正離子MS1Scan模式下掃描各甜味劑的母離子。結(jié)果表明，愛德萬甜在正離子模式下有較強的質(zhì)譜信號，其他8種甜味劑在負離子模式下有較強的質(zhì)譜信號。因干燥氣流速、干燥氣溫度、鞘氣溫度、電壓、駐留時間等因素均會影響靈敏度，所以在不同的條件下進行了多次試驗，最終確定的質(zhì)譜條件是：毛細管電壓：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛細管反吹干燥氣溫度：280℃；毛細管反吹干燥氣流量：9L/min；霧化器壓力：40psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L/min；噴嘴電壓：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式MRM；駐留時間：40ms。在上述質(zhì)譜條件下，對目標產(chǎn)物離子進行了自動優(yōu)化，檢測得到9種甜味劑化合物選擇離子流圖，詳見圖1，9種甜味劑化合物響應(yīng)值與靈敏度都表現(xiàn)良好，目標物的信號與離子豐度較強。最終MRM優(yōu)化參數(shù)結(jié)果詳見表2。

3.線性范圍和檢出限。按5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L配制混合標準曲線濃度，在優(yōu)化后的色譜和串聯(lián)質(zhì)譜條件下進行測定。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制校準曲線，得到標準曲線回歸方程，詳見表3。從表3可見，9種甜味劑在各自測定范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.998，檢出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L，靈敏度較高。

4.精密度和穩(wěn)定性試驗。取濃度分別為50μg/L、100μg/L、400μg/L且放置10天的三個混合標準溶液，在優(yōu)化后的色譜和串聯(lián)質(zhì)譜條件下各連續(xù)進樣6次，考察儀器的精密度，結(jié)果見表4。從表4可見，不同濃度標準品保留時間和峰面積的RSD分別是0.00%-0.210%和0.047%-1.400%，說明儀器的精密度和穩(wěn)定性良好。

5.回收率試驗。分別稱取不含有分析物的來自西雙版納州不同縣市的三個白酒樣品各1份，分別加入高、中、低3種濃度（200μg/L、100μg/L、50μg/L）的混合標準溶液，按上述樣品前處理步驟進行試驗，計算其回收率，結(jié)果見表5。由表5可見，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、愛德萬甜、紐甜、甜菊糖苷的加標回收率在95.2%-118.4%之間，說明該檢測方法有較好的準確度，可以滿足日常檢測要求。

6.樣品分析。按優(yōu)化后的試驗分析方法，對西雙版納州三個縣市30個市售小曲清香型白酒樣品進行檢測，9種甜味劑均無響應(yīng)值，即均未檢出，符合國家對白酒甜味劑的要求。

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了云南小曲清香白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、愛德萬甜、紐甜、甜菊糖苷九種人工甜味劑同時檢測的分析方法。該方法在8min內(nèi)完成九種甜味劑目標化合物的分離，且安賽蜜、阿力甜、愛德萬甜在質(zhì)量濃度為5.0μg/L-100μg/L，糖精鈉、紐甜在質(zhì)量濃度為5.0μg/ L-200μg/L，阿斯巴甜在質(zhì)量濃度為5.0-400μg/L，甜蜜素、三氯蔗糖、甜菊糖苷在質(zhì)量濃度為5.0μg/L-500μg/L時，有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.998，檢出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L。結(jié)果表明，該方法檢測準確，靈敏度高，大大提高了分析效率，降低了儀器檢測限和方法定量限，可為云南小曲清香白酒人工甜味劑非法添加的檢測提供技術(shù)支撐。