顧陽(yáng) 譚海 員林娜 孫海彥 常景玲 李志剛

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng) 453003；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海南省熱帶微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作為生物體的第二信使，對(duì)新陳代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用［1-2］，作為藥物具有提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)血液循環(huán)、改善心血管功能、預(yù)防過敏性疾病等功能，作為飼料添加劑在畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛［3-4］。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)cAMP時(shí)，存在嚴(yán)重的“碳溢流”現(xiàn)象并伴隨著副產(chǎn)物腺苷（AR）的大量積累?！疤家缌鳌奔刺墙徒馔緩脚c三羧酸循環(huán)之間碳流不匹配，導(dǎo)致大量有機(jī)酸（乙酸和乳酸）產(chǎn)生；不僅大大降低cAMP對(duì)碳源的得率，導(dǎo)致碳源的嚴(yán)重浪費(fèi)，還會(huì)引起培養(yǎng)環(huán)境的酸化，不利于菌體的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物合成［5-6］。副產(chǎn)物AR和cAMP均以AMP為原料合成，存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，AR積累會(huì)影響產(chǎn)物產(chǎn)量和糖苷轉(zhuǎn)化率的提高。另外，cAMP和AR性質(zhì)相近，AR的積累大大增加了產(chǎn)物分離純化的難度和成本。因此，合理調(diào)節(jié)碳代謝，減少有機(jī)酸和AR的積累是提高cAMP產(chǎn)量與得率的有效手段。

目前，關(guān)于調(diào)節(jié)代謝流改善cAMP發(fā)酵性能的研究主要集中在抑制糖酵解途徑、強(qiáng)化能量代謝以及工藝條件優(yōu)化等方面［7-8］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，通過外源添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉以及低聚磷酸鹽等輔助能量物質(zhì)，促進(jìn)前體ATP的合成，改變代謝流分配，提高了cAMP產(chǎn)量和生產(chǎn)效率［9-10］。Chen等［11］利用不同抑制劑對(duì)糖酵解途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)氟化鈉能夠緩解“碳溢流”現(xiàn)象，有利于cAMP的合成。Song等［12］通過離子束注入法對(duì)節(jié)桿菌進(jìn)行誘變處理，成功篩選到cAMP高產(chǎn)菌株，并利用糖酵解抑制劑大幅提高了cAMP產(chǎn)量。

氟化鈉是一種常見的糖酵解抑制劑，對(duì)丙酮酸激酶和烯醇化酶具有較強(qiáng)的抑制作用［13-14］。cAMP發(fā)酵過程中，利用氟化鈉促進(jìn)產(chǎn)物合成的方法已經(jīng)使用多年［11］。Niu等［15］通過13C 葡萄糖標(biāo)記法進(jìn)行代謝通量分析發(fā)現(xiàn)，氟化鈉提高了HMP途徑的通量，促進(jìn)了cAMP的生物合成。但以上研究只關(guān)注了氟化鈉對(duì)糖酵解和磷酸戊糖途徑中代謝通量的影響，忽視了氟化鈉對(duì)能量代謝及副產(chǎn)物AR合成的影響。在發(fā)酵過程中，cAMP由ATP直接環(huán)化形成，而ATP磷酸化所需能量主要由NADH氧化交出電子并經(jīng)電子呼吸鏈傳遞提供，強(qiáng)化能量代謝有利于產(chǎn)物合成［9］，另外，AR是由AMP在5′-核苷酸酶催化下脫磷酸生成，AR與產(chǎn)物合成均以AMP為底物，抑制5′-核苷酸酶活性，減少副產(chǎn)物AR積累，可以有效提高糖苷轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物合成。本研究針對(duì)cAMP發(fā)酵合成的特點(diǎn)，從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、各相關(guān)途徑碳通量和能量代謝等角度探討氟化鈉促進(jìn)產(chǎn)物合成的生理機(jī)制，旨為進(jìn)一步提高產(chǎn)物發(fā)酵性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實(shí)驗(yàn)室保藏的節(jié)桿菌Arthrobacter sp.CCTCC 2013431，培養(yǎng)基配制方法參見文獻(xiàn)［9］。

1.1.2 儀器 SW-CJ-2FD雙人垂直凈化工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；LMQ.C-100E高壓滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；ZWF-2112搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；BIOTECH-7BG機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備有限公司；UV-2800紫外分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；液相色譜儀島津LC-2030C 日本島津儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)操作詳見前期研究［9］。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中氟化鈉添加量分別0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 g/L，每個(gè)條件做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.2 分析方法 菌體干重（DCW）和葡萄糖測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［7］。腺苷酸環(huán)化酶與琥珀腺苷酸合成酶活性測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［16］。5′-核苷酸酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、丙酮酸激酶及己糖激酶活性采用試劑盒（Solarbio）進(jìn)行測(cè)定，比酶活以U/mg蛋白表示。NADH和NAD+濃度采用試劑盒（Solarbio）進(jìn)行測(cè)定。

乙酸和乳酸采用高效液相色譜法測(cè)定［17-18］。胞內(nèi)代謝物檸檬酸、丙酮酸和草酰乙酸含量采用高效液相色譜法測(cè)定［19］。cAMP、腺苷、次黃嘌呤以及胞內(nèi)ATP、AMP濃度測(cè)定均使用高效液相色譜測(cè)定［9，12］。天冬氨酸和谷氨酸采用Waters公司開發(fā)的AccQ-Tag法測(cè)定，操作方法和步驟按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同氟化鈉添加量對(duì)cAMP發(fā)酵合成的影響

有研究表明，氟化鈉可以有效降低糖酵解途徑的碳通量［11］，促進(jìn)cAMP的發(fā)酵合成。在250 mL錐形瓶中進(jìn)行了添加不同濃度氟化鈉的發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著添加量的逐漸增加菌體濃度（DCW）和葡萄糖消耗量呈下降趨勢(shì)，而cAMP產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率則隨添加量增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，氟化鈉添加量為0.2 g/L時(shí)，cAMP產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高值3.16 g/L和0.103 g/g，比對(duì)照（未添加氟化鈉）分別提高了35.6%和41.1%。表明添加氟化鈉雖然一定程度上抑制了菌體生長(zhǎng)，卻能有效提高cAMP產(chǎn)量和得率。另外，氟化鈉添加量超過0.25 g/L時(shí)，菌體濃度、葡萄糖消耗，以及cAMP產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均快速下降，表明高濃度的氟化鈉強(qiáng)烈抑制菌體生長(zhǎng)和正常代謝，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的急劇下降（表1）。

2.2 7 L發(fā)酵罐中添加氟化鈉提高cAMP發(fā)酵整體性能

在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了添加0.2 g/L氟化鈉的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。添加與未添加氟化鈉兩批次中，次黃嘌呤濃度在發(fā)酵30 h后降至0.2 g/L以下，不再變化（圖1-B），表明發(fā)酵30 h后次黃嘌呤消耗殆盡，沒有嘌呤類物質(zhì)存在條件下菌體開始通過從頭合成途徑生產(chǎn)cAMP（從頭合成發(fā)酵模式）。發(fā)酵72 h，添加氟化鈉批次的cAMP產(chǎn)量達(dá)到3.36 g/L，與對(duì)照批次相比，提高了25.8%，由于葡萄糖消耗量在兩批次中相差很小，cAMP得率也得到等幅度的提高。與對(duì)照批次相比，腺苷、乙酸和乳酸等副產(chǎn)物的積累量均顯著下降，分別降低了61.1%、54.8%和55.4%。腺苷與cAMP的合成都以AMP為原料，存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，腺苷積累減少有利于cAMP產(chǎn)量和得率的提高；有機(jī)酸生成量下降不僅減少了碳源的浪費(fèi)，而且使pH在發(fā)酵前期下降速度緩慢，后期回升加速，改善了培養(yǎng)環(huán)境（圖1-D）?？傊?，通過從頭合成發(fā)酵模式生產(chǎn)cAMP時(shí)，適量添加氟化鈉可以有效降低副產(chǎn)物的積累，緩解“碳溢流”現(xiàn)象，促進(jìn)cAMP的合成。

與從頭合成途徑相比，補(bǔ)救途徑能夠直接利用外源嘌呤類物質(zhì)進(jìn)行cAMP的合成，代謝途徑縮短，能量消耗降低，產(chǎn)物合成效率高。在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了添加0.2 g/L氟化鈉的cAMP補(bǔ)救合成模式發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵29 h向發(fā)酵液中添加1 g/L次黃嘌呤，使菌體繼續(xù)通過補(bǔ)救途徑合成產(chǎn)物。如圖2-B所示，與對(duì)照相比，添加氟化鈉批次中次黃嘌呤利用更快速，最終發(fā)酵液中殘留濃度也明顯低于對(duì)照；cAMP產(chǎn)量在68 h達(dá)到最大值4.35 g/L，比對(duì)照批次提高了27.9%，兩批次中葡萄糖消耗量相當(dāng)，cAMP得率也得到顯著提高。此外，腺苷含量比對(duì)照批次的減少了64.1%，有機(jī)酸積累量也顯著降低（數(shù)據(jù)未給出）。以上結(jié)果表明，利用補(bǔ)救合成模式發(fā)酵cAMP時(shí)，添加適量氟化鈉能夠促進(jìn)次黃嘌呤的快速利用，減少副產(chǎn)物腺苷和有機(jī)酸的積累，使更多碳源用于產(chǎn)物合成，促進(jìn)cAMP產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的提高。

圖1 氟化鈉對(duì)cAMP從頭合成發(fā)酵模式整體性能的影響Fig.1 Effects of NaF on cAMP fermentation production by de novo synthesis fermentation mode

圖2 氟化鈉對(duì)cAMP補(bǔ)救合成發(fā)酵模式整體性能的影響Fig.2 Effects of NaF on cAMP fermentation production by salvage synthesis fermentation mode

2.3 氟化鈉對(duì)cAMP合成途徑中關(guān)鍵酶活性的影響

cAMP生物合成途徑涉及磷酸戊糖途徑、腺苷酸合成途徑以及AMP磷酸化、ATP環(huán)化等過程，碳代謝流分配直接影響著產(chǎn)物的合成，而糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑間的碳流分配尤為重要。己糖激酶（hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途徑的限速酶，活性強(qiáng)弱反映了糖酵解途徑的代謝強(qiáng)度。6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）和琥珀腺苷酸合成酶（sAMPase）分別是磷酸戊糖途徑和腺苷酸合成途徑的關(guān)鍵酶，分別反映了碳流在兩條途徑中分配情況。對(duì)添加與未添加氟化鈉批次26、36、50和60 h樣品的胞內(nèi)HK、PK、G6PDH和sAMPase的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照批次相比，添加氟化鈉批次的HK活性有很小幅度的下降，并不顯著，而PK活性顯著下降，在36 h下降幅度最大達(dá)到40.2%，同時(shí)，G6PDH和sAMPase的活性明顯提高，最大漲幅分別達(dá)到100%和72.7%。表明氟化鈉添加對(duì)菌體利用葡萄糖的影響不大，但糖酵解途徑已經(jīng)被顯著抑制，更多的碳流分配到磷酸戊糖途徑，進(jìn)而通過腺苷酸合成途徑轉(zhuǎn)化為AMP，為產(chǎn)物合成提供原料。

圖3 氟化鈉對(duì)cAMP合成相關(guān)途徑中關(guān)鍵酶活性的影響Fig.3 Effects of NaF on the activities of key enzymes presented in cAMP biosynthesis pathways

AMP一方面經(jīng)磷酸化形成ATP，進(jìn)而由腺苷酸環(huán)化酶（AC）催化合成cAMP，一方面在5′-核苷酸酶（5-NT）作用下脫去磷酸基形成腺苷，腺苷大量形成必然對(duì)cAMP的積累以及后續(xù)分離純化過程產(chǎn)生不利影響。對(duì)添加與未添加氟化鈉批次的AC和5-NT的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明AC活性在氟化鈉的作用下明顯提高，而5-NT的活性卻大幅下降（圖4）。表明副產(chǎn)物腺苷的合成受到氟化鈉的抑制，產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)AMP的壓力減弱，同時(shí)AC活性提高為產(chǎn)物合成提供了有力條件。

2.4 氟化鈉對(duì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物含量的影響

細(xì)胞內(nèi)中間代謝物含量的變化一定程度上反映了代謝流分配情況。對(duì)糖酵解、三羧酸循環(huán)中的代謝物丙酮酸、草酰乙酸和檸檬酸，產(chǎn)物合成的前體氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照批次相比，添加氟化鈉使丙酮酸含量明顯減少，草酰乙酸和檸檬酸含量變化不顯著，而天冬氨酸和谷氨酸含量有明顯的增加。氟化鈉顯著的抑制了糖酵解途徑，同時(shí)三羧酸循環(huán)代謝強(qiáng)度并沒有明顯的改變，考慮到乙酸和乳酸合成顯著下降的現(xiàn)象（圖1-C），猜想氟化鈉使原用于合成乙酸和乳酸的碳流分配到磷酸戊糖途徑，從而緩解了“碳溢流”現(xiàn)象，而進(jìn)入三羧酸循環(huán)的碳流并未受到明顯影響。另外，前體氨基酸含量增加也為產(chǎn)物的合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖4 氟化鈉對(duì)腺苷酸環(huán)化酶和5′-核苷酸酶活性的影響Fig.4 Effects of NaF on the activities of AC and 5-NT

圖5 氟化鈉對(duì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物含量的影響Fig.5 Effects of NaF on main intracellular metabolites contents

2.5 氟化鈉對(duì)cAMP生物合成過程中能量代謝的影響

cAMP由ATP在腺苷酸環(huán)化酶作用下直接環(huán)化合成，胞內(nèi)高ATP含量和ATP/AMP有利于產(chǎn)物合成。AMP磷酸化合成ATP所需能量主要由電子呼吸鏈提供，而NADH是電子呼吸鏈的主要電子供體，因此，NADH/NAD+的提高可以促進(jìn)ATP的生成，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)物合成。對(duì)添加與未添加氟化鈉批次的ATP/AMP和NADH/NAD+進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明添加氟化鈉致使ATP/AMP和NADH/NAD+明顯提高（圖6），為產(chǎn)物合成提供有利條件。這可能是由于氟化鈉抑制了糖酵解途徑，緩解了“碳溢流”現(xiàn)象，使有機(jī)酸生成量大幅減少（圖1-C），NADH的消耗隨之下降（乙酸和乳酸生成需要NADH作為輔酶），最終導(dǎo)致NADH/NAD+和ATP/AMP得到明顯提升。

3 討論

cAMP微生物合成過程具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，受到越來越多的關(guān)注。目前，能夠積累cAMP的微生物主要來源于微桿菌屬（Microbacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）及酵母菌屬（Saccharomyces），其中節(jié)桿菌研究最多［20］。然而，cAMP發(fā)酵過程中存在嚴(yán)重的“碳溢流”現(xiàn)象，導(dǎo)致大量有機(jī)酸產(chǎn)生，不僅造成碳源的浪費(fèi)，酸性條件還會(huì)影響細(xì)胞正常代謝和產(chǎn)物合成［5］?！疤家缌鳌笔怯捎谔墙徒馔緩胶腿人嵫h(huán)之間碳流不匹配導(dǎo)致的，前者的代謝通量超過后者，過剩的碳流在消耗大量NADH的條件下，形成有機(jī)酸釋放到胞外［21］。通過敲除關(guān)鍵酶基因和添加抑制劑弱化糖酵解途徑的代謝強(qiáng)度，能夠使代謝流重新分配，更多的分配到磷酸戊糖途徑，“碳溢流”現(xiàn)象能夠得到緩解［11，22］。

圖6 添加氟化鈉對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的影響Fig.6 Effects of NaF on NADH/NAD+ and ATP/AMP

由于缺少有效的基因改造手段，相關(guān)報(bào)道主要通過添加抑制劑的方式對(duì)cAMP生產(chǎn)菌株進(jìn)行代謝調(diào)控［23］。有研究表明，氟化鈉能夠有效抑制丙酮酸激酶和烯醇化酶活性，進(jìn)而降低糖酵解途徑的代謝通量［13-14］。Chen等［11］使用氟化鈉、碘乙酸、檸檬酸等多種抑制劑弱化糖酵解途徑發(fā)現(xiàn)，氟化鈉的效果最好，有效緩解“碳溢流”現(xiàn)象，cAMP產(chǎn)量得到顯著提高。本研究中，通過向cAMP發(fā)酵液中添加氟化鈉，丙酮酸激酶活性顯著下降，而6-磷酸葡萄糖脫氫酶、琥珀腺苷酸合成酶及腺苷酸環(huán)化酶等活性得到明顯提升，同時(shí)有機(jī)酸積累大幅下降，cAMP產(chǎn)量顯著提高。表明氟化鈉有效抑制糖酵解途徑，緩解了“碳溢流”現(xiàn)象，使更多碳流分配到產(chǎn)物合成途徑。另外，由于5′-核苷酸酶活性顯著降低，產(chǎn)物合成的一條分支途徑被抑制，副產(chǎn)物腺苷的積累顯著下降，為提高cAMP產(chǎn)量和得率提供有利條件。

在微生物細(xì)胞內(nèi)，cAMP以ATP為底物直接環(huán)化形成，ATP持續(xù)高效合成是促進(jìn)產(chǎn)物合成的重要因素［22］。ATP合成不僅需要前體氨基酸（天冬氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸）和戊糖等原料，還需要磷酸化反應(yīng)所需的能量［10，19］。前期研究中，通過外源添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉以及低聚磷酸鹽等輔助能量物質(zhì)，促進(jìn)前體ATP的合成，提高了cAMP產(chǎn)量和生產(chǎn)效率［9-10］。本研究中由于氟化鈉的作用，胞內(nèi)前體氨基酸含量明顯提高，為產(chǎn)物合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)由于有機(jī)酸合成量降低，NADH消耗量大幅減少，使NADH/NAD+得到明顯提高，為產(chǎn)物合成奠定了能量基礎(chǔ)。氟化鈉促進(jìn)cAMP生物合成機(jī)制的闡述，為高產(chǎn)菌株篩選和高產(chǎn)策略開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。在后續(xù)工作中，將著重于cAMP生物合成途徑代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的研究以及有效基因編輯工具的開發(fā)，進(jìn)一步闡明cAMP合成調(diào)控機(jī)制，提高產(chǎn)物產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。

4 結(jié)論

通過添加0.2 g/L氟化鈉，兩種發(fā)酵模式（從頭合成模式和補(bǔ)救合成模式）的cAMP產(chǎn)量分別達(dá)到3.36 g/L和4.35 g/L，與對(duì)應(yīng)未添加氟化鈉批次相比，分別提高了25.8%和27.9%，腺苷和有機(jī)酸合成量顯著降低，發(fā)酵性能得到明顯改善。對(duì)cAMP合成途徑關(guān)鍵酶活性測(cè)定結(jié)果表明，氟化鈉抑制了PK和5-NT活性，而G6PDH、sAMPase和AC的活性得到明顯提高，表明糖酵解途徑和5-NT受到抑制，有機(jī)酸和腺苷合成受阻，更多碳流分配到產(chǎn)物合成途徑。通過氟化鈉的添加，ATP/AMP和NADH/NAD+均得到明顯提高，是由于有機(jī)酸合成量大幅減少，NADH的消耗隨之下降，促進(jìn)了ATP的合成，為產(chǎn)物合成提供有利條件。