蔣 偉，王曉娟，梁 姣，吳 韜，謝東瑋，曹興華

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)是廣泛用于心臟外科手術(shù)的技術(shù)，通過特殊裝置及人工管道將靜脈血引流至體外并進行氣體交換及特殊處理，而后輸回動脈系統(tǒng)，能夠保證心臟直視手術(shù)順利完成。但是，CPB能夠使心肌經(jīng)歷缺血及再灌注的過程，缺血再灌注會造成心肌損傷，增加術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生風(fēng)險[1-2]。如何減輕CPB后心肌缺血再灌注損傷一直是心胸外科的研究熱點。七氟烷是一種新型的吸入型麻醉藥物，使用七氟烷進行預(yù)處理能夠減輕心肌缺血再灌注損傷。已有多項動物實驗證實，七氟烷能夠通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激減輕腦組織缺血再灌注損傷[3-4]，但七氟烷預(yù)處理減輕體外循環(huán)過程中心肌缺血再灌注損傷的作用是否與抑制炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)報道較少。本研究探討七氟烷預(yù)處理減輕體外循環(huán)心肌缺血再灌注損傷的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2018年12月在我院接受擇期心臟瓣膜置換術(shù)的病人120例作為研究對象，入組標準：①符合心臟瓣膜疾病診斷標準及CPB下瓣膜置換術(shù)的指證；②心功能Ⅰ級～Ⅲ級；③美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(ASA)分級Ⅰ級或Ⅱ級；④獲得病人知情同意。排除標準：①合并高血壓、糖尿病、冠心??；②合并感染性疾病、自身免疫性疾病；③肝、腎、肺功能不全；④既往有手術(shù)病史。采用隨機數(shù)字表法分為預(yù)處理組與對照組，每組60例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 病人進入手術(shù)室后，連接心電監(jiān)護后靜脈輸注地塞米松磷酸鈉注射液10 mg，依次給予咪達唑侖0.1 mg/kg、依托咪酯0.2～0.4 mg/kg、舒芬太尼0.2～0.4 μg/kg、羅庫溴銨0.8～1.0 mg/kg靜脈推注以完成麻醉誘導(dǎo)，氣管插管后進行麻醉維持：咪達唑侖0.05～0.10 mg/(kg·h)、舒芬太尼0.5～1.0 μg/(kg·h)、羅庫溴銨0.1～0.5 mg/(kg·h)、右美托咪定0.5～1.0 μg/(kg·h)持續(xù)泵注。預(yù)處理組在麻醉誘導(dǎo)及氣管插管完成后給予2%～5%的七氟烷吸入，氧流量4 L/min，調(diào)整七氟烷吸入濃度并使CETSev達到1 MAC并維持20 min，關(guān)閉七氟烷并洗脫10 min；對照組在麻醉誘導(dǎo)及氣管插管完成后不給予其他特殊處理。

1.2.2 樣本收集方法 麻醉誘導(dǎo)前(T0)、CPB前即刻(T1)、CPB后即刻(T2)、CPB后24 h(T3)，分別采集肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心分離血清后，-80 ℃保存待測。T1和T2時，采集右心耳組織少量，預(yù)冷的生理鹽水清洗殘留血液后液氮冷凍30 min，放置在-80 ℃保存待測。

1.2.3 血清指標檢測方法 取血清標本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)的含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)試劑盒檢測丙二醛(MDA)含量，采用比色法試劑盒檢測總抗氧化能力(T-AOC)。 ELISA試劑盒購自上海西唐生物公司，TBA試劑盒、比色法試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 基因表達檢測方法 取右心耳組織，采用RIPA裂解液分離組織中的蛋白樣本，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白含量后取50 μg總蛋白與上樣緩沖液混合，進行蛋白免疫印跡(Western Blot)，將蛋白樣本加入預(yù)先配置好的聚丙烯酰胺凝膠的點樣孔內(nèi)，垂直電泳至上樣緩沖液中的溴酚藍條帶移動至凝膠底部，而后進行電轉(zhuǎn)膜，將蛋白樣本從凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂牛奶在室溫孵育NC膜2 h，用核因子-κB(NF-κB)、核因子-κB抑制因子(I-κB)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)2、NOX4的第一抗體在4 ℃孵育NC膜過夜；第2天，用第二抗體在室溫孵育NC膜2 h后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計算蛋白表達量。RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天公司，NF-κB、I-κB、NOX2、NOX4的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組內(nèi)不同時間點的比較采用重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組圍術(shù)期心肌酶含量比較 T0、T1時，兩組血清LDH、CK、CK-MB含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與T0、T1比較，兩組T2、T3時血清LDH、CK、CK-MB含量均明顯升高(P<0.05)；與對照組比較，預(yù)處理組T2、T3時血清LDH、CK、CK-MB含量均明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組圍術(shù)期LDH、CK、CK-MB含量比較(±s) 單位：U/L

2.2 兩組炎癥反應(yīng)指標比較 T0、T1時，兩組血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與T0、T1比較，兩組T2、T3時血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量均明顯升高(P<0.05)；與對照組比較，預(yù)處理組T2、T3時血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量均明顯降低(P<0.05)。詳見表3。T1時，兩組右心耳組織中NF-κB、I-κB表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；T2時，預(yù)處理組右心耳組織中NF-κB表達量明顯低于對照組，I-κB表達量明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表4、圖1。

表3 兩組IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量比較(±s)

表4 兩組右心耳組織中NF-κB、I-κB表達量比較(±s)

圖1 兩組右心耳組織中NF-κB、I-κB的蛋白條帶

2.3 兩組氧化應(yīng)激反應(yīng)指標比較 T0、T1時，兩組血清MDA、AOPP、T-AOC比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與T0、T1時比較，兩組T2、T3時血清MDA、AOPP含量均明顯升高(P<0.05)，T-AOC明顯降低(P<0.05)；與對照組比較，預(yù)處理組T2、T3時血清MDA、AOPP含量均明顯降低(P<0.05)，T-AOC明顯升高(P<0.05)。詳見表5。T1時，兩組右心耳組織中NOX2、NOX4表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；T2時，預(yù)處理組右心耳組織中NOX2、NOX4的表達量明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表6、圖2。

表5 兩組MDA、AOPP、T-AOC比較(±s)

表6 兩組右心耳組織中NOX2、NOX4表達量比較(±s)

圖2 兩組右心耳組織中NOX2、NOX4的蛋白條帶

3 討 論

CPB過程中心肌經(jīng)歷了缺血再灌注，缺血再灌注通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡等途徑加劇心肌損傷，CPB后心肌缺血再灌注損傷會增加心血管事件發(fā)生風(fēng)險，嚴重者會發(fā)生心源性猝死[5-6]。七氟烷是具有抗炎、抗氧化作用的吸入型麻醉藥物，張亮等[7]的動物實驗研究報道，七氟烷能夠減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的程度；陳勤等[8]的臨床研究報道，CPB前使用七氟烷預(yù)處理能夠減輕心肌缺血再灌注損傷的程度，減少CPB后多種心肌酶的釋放。本研究在心臟瓣膜置換術(shù)全身麻醉前進行了七氟烷預(yù)處理，通過觀察圍術(shù)期心肌酶的變化來反映心肌缺血再灌注損害的程度，與麻醉誘導(dǎo)前及CPB前即刻比較，兩組CPB后即刻及CPB后24 h血清LDH、CK、CK-MB含量均明顯升高，說明CPB后病人出現(xiàn)了明顯的心肌損傷。預(yù)處理組CPB后即刻及CPB后24 h血清LDH、CK、CK-MB含量均明顯低于對照組，這一結(jié)果與陳勤等[8]的研究結(jié)果一致，說明七氟烷預(yù)處理能夠減輕CPB后心肌缺血再灌注的損傷。

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活是缺血再灌注引起心肌損傷的重要病理環(huán)節(jié)，一方面，炎癥和氧化應(yīng)激能夠造成心肌細胞損害；另一方面，炎癥和氧化應(yīng)激也能激活細胞凋亡并造成心肌細胞損害。七氟烷的抗炎及抗氧化作用已經(jīng)在腦缺血再灌注、肝缺血再灌注、膿毒癥大鼠模型中被證實[9-11]，但該藥物在CPB后心肌缺血再灌注過程中的抗炎及抗氧化作用尚未明確。在炎癥反應(yīng)激活的過程中，IL-1β、TNF-α、ICAM-1等細胞因子呈瀑布式釋放，既能介導(dǎo)炎癥的級聯(lián)放大，也能作為評價炎癥程度的標志物[12-13]。在氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的過程中，氧自由基大量生成并攻擊細胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)，引起細胞結(jié)構(gòu)損傷的同時也導(dǎo)致氧化產(chǎn)物MDA及AOPP大量生成、T-AOC下降[14]。本研究通過血清炎癥指標及氧化應(yīng)激指標的變化來評價CPB前后心肌炎癥及氧化應(yīng)激損害的程度，與麻醉誘導(dǎo)前及CPB前即刻比較，兩組CPB后即刻及CPB后24 h血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MDA及AOPP均增多，而T-AOC均下降，說明CPB后炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯激活；預(yù)處理組CPB后即刻及CPB后24 h血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MDA及AOPP均低于對照組，而T-AOC高于對照組，說明七氟烷預(yù)處理能夠減輕CPB后的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而也提示七氟烷能夠通過抗炎及抗氧化作用來減輕CPB后的心肌損傷。

以上血清心肌酶及炎癥指標、氧化應(yīng)激指標能夠反映心肌損害的程度及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的變化，但均不是CPB前后心肌組織中炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)變化的直接證據(jù)。為了獲得CPB前后心肌組織中炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)變化的直接證據(jù)，本研究在獲得倫理委員會批準后采集了右心耳組織并通過Western Blot對炎癥基因、氧化應(yīng)激基因的表達進行了分析。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，I-κB是其特異性抑制分子；在缺血缺氧、缺血再灌注、感染等病理因素的刺激下，I-κB的活性受到抑制，對NF-κB的抑制作用也被削弱，NF-κB活化后大量進入細胞核并啟動IL-1β、TNF-α、ICAM-1等基因的表達并使炎癥反應(yīng)發(fā)生激活[15-16]。NOX2和NOX4是NOXs家族中在心肌內(nèi)表達的主要成員，能夠直接介導(dǎo)氧自由基的生成并使氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生激活[17]。本研究結(jié)果顯示，預(yù)處理組CPB后即刻心肌中NF-κB、NOX2、NOX4的表達均明顯低于對照組，I-κB的表達明顯高于對照組，說明七氟烷預(yù)處理能夠直接抑制心肌組織中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活。

綜上所述，七氟烷預(yù)處理能夠通過抗炎和抗氧化作用減輕CPB后的心肌缺血再灌注損傷，本研究的局限之處是僅僅通過臨床數(shù)據(jù)來探究七氟烷的心肌保護作用，雖然通過心肌組織中基因表達的變化能夠直接反映炎癥和氧化應(yīng)激的程度，但仍需要在今后的研究中進一步探討七氟烷對心肌CPB后炎癥及氧化應(yīng)激的影響。