宋愛(ài)新，王 璐，張媛媛

慢性心力衰竭是各種心血管疾病終末期階段的共同表現(xiàn)，由于心肌受損導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能變化，最終引起心室射血及充盈能力受損的一組臨床綜合征，其發(fā)病率和住院率均較高，是心血管疾病病人死亡的主要原因之一[1]。慢性心力衰竭病因復(fù)雜，常見病因主要有冠心病、高血壓、風(fēng)濕性心臟病等，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、水腫等，病理學(xué)表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大變性、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)及心功能下降[2]。目前，臨床上主要使用β-受體阻滯劑、利尿劑等西藥治療，但有較多不良反應(yīng)和禁忌證。黃芪是中國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、托毒利膿、固表止汗、利水消腫等作用，在心血管系統(tǒng)疾病方面有廣泛應(yīng)用前景[3]。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，ASⅣ)是從黃芪中提取的一種皂苷類化合物，具有保護(hù)心肌細(xì)胞、提高心臟功能等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病具有一定治療作用[4-5]。ASⅣ已被證實(shí)具有保護(hù)心肌作用，但其具體作用機(jī)制研究較少，本研究通過(guò)建立慢性心力衰竭大鼠模型，觀察黃芪甲苷對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能作用機(jī)制，為臨床治療慢性心力衰竭提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠55只，雄性，7周齡，體質(zhì)量(260±20)g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0004。保持溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度為(55±5)%，明暗周期12 h/12 h，大鼠購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 黃芪甲苷(純度≥98%，南京春秋生物工程有限公司)，鹽酸貝那普利片(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20053390，10 mg，成都地奧制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn))，原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(北京中杉試劑公司)，兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)多抗、Smad3多抗、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteiny aspartate specific protease-3，Caspase-3)多抗(美國(guó)Abcam公司)，VEVO2100小動(dòng)物高分辨率超聲成像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)，iWorx動(dòng)物多導(dǎo)生理記錄儀(美國(guó)iWorx公司)。

1.3 方法

1.3.1 慢性心力衰竭大鼠模型的建立及分組 隨機(jī)取45只大鼠，依照文獻(xiàn)[6]方法，采用主動(dòng)脈縮窄法建立慢性心力衰竭大鼠模型。大鼠術(shù)前禁食不禁水24 h，使用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后仰臥固定，腹部備皮，自劍突下1 cm處腹部正中縱向切口，約2 cm，分離皮膚，打開腹腔，游離腹主動(dòng)脈，采用4號(hào)手術(shù)線進(jìn)行結(jié)扎，使腹主動(dòng)脈縮窄至原來(lái)直徑的40%～60%，關(guān)閉腹腔，逐層縫合。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)8周，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)造模大鼠心功能，顯示左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)≤45%，表示造模成功。將造模成功的41只大鼠隨機(jī)分為模型組(11只)、ASⅣ低劑量組(10只)、ASⅣ高劑量組(10只)和陽(yáng)性對(duì)照組(10只)。剩余10只大鼠作為假手術(shù)組，分離腹主動(dòng)脈，但不結(jié)扎，其余操作同上。所有大鼠術(shù)后按每只2×105U青霉素腹腔注射以防感染，連續(xù)注射3 d。

1.3.2 干預(yù)方法 末次干預(yù)12 h后，ASⅣ和鹽酸貝那普利片以1%羧甲基纖維素(CMC)溶解，根據(jù)臨床人用劑量等量換算，ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠分別按體質(zhì)量灌胃25 mg/kg、50 mg/kg黃芪甲苷溶液和0.9 mg/kg鹽酸貝那普利溶液，模型組和假手術(shù)組給予同體積的1% CMC灌胃。每天干預(yù)1次，連續(xù)8周。

1.3.3 超聲檢測(cè)心功能指數(shù) 末次灌胃后2 h，將大鼠仰臥固定，超聲檢測(cè)心功能。記錄大鼠LVEF、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic dimension，LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)。

1.3.4 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 心功能檢測(cè)完畢后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頸部備皮后右側(cè)頸部行2 cm切口，分離頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端做一切口，導(dǎo)管一端經(jīng)此切口插入左心室，另一端接壓力傳感器，連接生理信號(hào)采集系統(tǒng)，測(cè)定左室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮末壓(left ventricular end systolic pressure，LVESP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.3.5 蘇木素-伊紅(HE)染色和Massion染色觀察心肌病理變化 檢測(cè)完血流動(dòng)力學(xué)，處死大鼠，開胸取出心臟，沖洗干凈，濾紙吸干水分和血跡，沿房室溝剪去左右心房，剪掉主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，剪去右心室，留取左心室，從左心室中部橫軸切下部分心肌組織(約0.5 cm厚)于4%多聚甲醛中固定72 h。經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片(厚度約4 μm)后分別進(jìn)行HE染色和Massion染色，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后置于顯微鏡下觀察心肌病理變化。

1.3.6 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況 取心肌石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水處理，加入3%過(guò)氧化氫(H2O2)處理，蛋白酶K消化20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，加入TUNEL反應(yīng)液，37 ℃濕盒中反應(yīng)1 h，PBS沖洗，加入POD轉(zhuǎn)化劑，37 ℃反應(yīng)30 min，PBS沖洗，加入DAB顯色，封片鏡檢，細(xì)胞核中有棕色顆粒者為凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.7 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)法檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad3、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 將剩余部分心肌組織放入液氮中保存。取液氮保存的心肌組織70 mg，研磨勻漿，離心后取上清液，提取總RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA，配制20 μL反應(yīng)體系，包括上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，2×SYBR Mixture 10 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)；以β-actin內(nèi)參作為對(duì)照，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列均由上海生工設(shè)計(jì)合成，基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.8 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取液氮保存心肌組織80 mg，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液，按照BCA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度，100 ℃水浴加熱10 min，蛋白變性。制備樣品，配制凝膠，蛋白上樣，加入等量上樣緩沖液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，TBST溶液洗膜3次，5%脫脂牛奶封閉2 h，將膜放入稀釋的TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Caspase-3一抗(1∶2 000)中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST溶液洗膜3次，放入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶50 000)中，室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，加入ECL發(fā)光液，曝光、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。以TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Caspase-3蛋白條帶灰度值與β-actin比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組、ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LVEF降低，LVESD、LVEDD升高(P<0.05)；與模型組比較，ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LVEF升高，LVESD、LVEDD降低(P<0.05)；與ASⅣ低劑量組比較，ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LVEF升高，LVESD、LVEDD降低(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組LVEF略高于ASⅣ高劑量組，LVESD、LVEDD略低于ASⅣ高劑量組，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組、ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低，LVEDP升高(P<0.05)；與模型組比較，ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax升高，LVEDP降低(P<0.05)；與ASⅣ低劑量組比較，ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax升高，LVEDP降低(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax高于ASⅣ高劑量組，LVEDP低于ASⅣ高劑量組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

2.3 HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化 HE染色顯示，假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞連接緊密；模型組心肌細(xì)胞水腫，肌纖維排列紊亂、斷裂，細(xì)胞間質(zhì)水腫，可見炎性浸潤(rùn)；ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組均較模型組有不同程度改善，心肌細(xì)胞損傷減輕，肌纖維排列較規(guī)則，其中ASⅣ高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組改善較明顯。詳見圖1。

圖1 心肌組織HE染色(×200)

2.4 Massion染色觀察心肌組織病理學(xué)變化 Massion染色顯示，假手術(shù)組僅有極少量膠原纖維分布于細(xì)胞間隙；模型組心肌細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維分布；ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組膠原纖維較模型組明顯減少。詳見圖2。

圖2 心肌組織Massion染色(×200)

2.5 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組、模型組、ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率分別為(3.67±1.59)%、(72.56±6.25)%、(43.14±5.18)%、(22.48±4.69)%、(19.58±4.62)%，細(xì)胞凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=327.466，P<0.001)。與假手術(shù)組比較，模型組、ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.001)；與模型組比較，ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.001)；與ASⅣ低劑量組比較，ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.001)；陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率略低于ASⅣ高劑量組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3。

圖3 心肌組織TUNEL染色(×400)

2.6 心肌組織TGF-β1、Smad3、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 心肌組織TGF-β1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組、ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組心肌組織TGF-β1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組的TGF-β1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)；與ASⅣ低劑量組比較，ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組TGF-β1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組TGF-β1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于ASⅣ高劑量組，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 心肌組織TGF-β1、Smad3、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

2.7 心肌組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組、ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組心肌組織TGF-β1、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，ASⅣ低劑量組、ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組TGF-β1、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)；與ASⅣ低劑量組比較，ASⅣ高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組TGF-β1、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組TGF-β1、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于ASⅣ高劑量組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5、圖4。

表5 心肌組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

圖4 心肌組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

多種病理因素均可引起慢性心力衰竭，導(dǎo)致心臟功能受損，使病人長(zhǎng)期反復(fù)住院治療，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量和生命健康。目前，研究認(rèn)為，引起慢性心力衰竭的關(guān)鍵因素主要有心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、心室重構(gòu)及多種信號(hào)通路異常激活或抑制等因素，經(jīng)過(guò)治療后，部分病人心臟功能得以恢復(fù)或者部分恢復(fù)，能夠改善病人臨床癥狀，提高預(yù)后[7-8]。ASⅣ具有廣泛的藥理作用，尤其在心血管疾病中的作用日漸受到重視，本研究從心臟結(jié)構(gòu)和功能、血流動(dòng)力學(xué)以及心肌細(xì)胞凋亡方面評(píng)價(jià)ASⅣ對(duì)慢性心力衰竭大鼠的心肌保護(hù)作用，初步探討其可能作用機(jī)制。

心室重構(gòu)是慢性心力衰竭的重要病理基礎(chǔ)，是指心肌受到外來(lái)因素影響出現(xiàn)的代償性改變，包括心室結(jié)構(gòu)和功能等方面的變化，抑制心室重構(gòu)是抑制心臟疾病的關(guān)鍵步驟[9-10]。LVEF、LVESD、LVEDD是評(píng)價(jià)心室結(jié)構(gòu)和功能的主要指標(biāo)，LVEF是心室泵血功能的重要參數(shù)，心室泵血功能是臨床判斷心功能的主要指標(biāo)，LVESD和LVEDD反映心室收縮功能。血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)是評(píng)價(jià)心肌收縮和舒張功能的重要指標(biāo)，LVESP和+dp/dtmax反映心肌收縮功能，LVEDP與心肌舒張功能呈負(fù)相關(guān)，-dp/dtmax反映心肌舒張功能。心肌纖維化是心室重構(gòu)的重要病理特征，發(fā)生慢性心力衰竭的大鼠心肌細(xì)胞凋亡率與心肌纖維化的變化程度呈正相關(guān)[11]。ASⅣ對(duì)心肌梗死動(dòng)物具有心肌保護(hù)作用，并可抑制慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)，改善心臟功能[12-13]。ASⅣ還可保護(hù)心肌細(xì)胞免受病毒性心肌炎引起的心肌細(xì)胞損傷和纖維化，減少心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞[14]。本研究成功建立慢性心力衰竭大鼠模型，經(jīng)不同劑量ASⅣ治療后，心功能指標(biāo)、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌病理形態(tài)均有明顯改善，抑制心肌細(xì)胞纖維化，降低細(xì)胞凋亡率，且ASⅣ高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的改善效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ASⅣ可減少慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡和纖維化，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，對(duì)心功能具有顯著改善作用。

TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在多種疾病的纖維化重構(gòu)中起關(guān)鍵作用。TGF-β1是激活成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵因子，通過(guò)誘導(dǎo)膠原纖維合成，引起器官纖維化，導(dǎo)致心室重構(gòu)，是引發(fā)心臟疾病的關(guān)鍵因素。Smad蛋白是TGF-β1下游介質(zhì)之一，Smad3是Smad家族成員之一，由TGF-β1激活，在心臟疾病中表達(dá)明顯上調(diào)，參與促進(jìn)心肌纖維化，引起心室重構(gòu)。TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活對(duì)心室重構(gòu)的致病過(guò)程起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用[15]。Caspase-3蛋白是凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，激活后可使凋亡抑制物失活，激活凋亡調(diào)節(jié)蛋白，促使細(xì)胞凋亡。研究顯示，在非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化疾病過(guò)程中，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路參與介導(dǎo)肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和纖維化[16-17]。已有研究顯示，在心肌梗死和心肌缺血再灌注動(dòng)物模型中，抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，可明顯抑制左心室重構(gòu)，發(fā)揮抗心肌重塑作用[18-19]。本研究經(jīng)不同劑量ASⅣ治療后，大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad3、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下降，心肌纖維化和凋亡率明顯下降，ASⅣ高劑量效果優(yōu)于低劑量，且與陽(yáng)性對(duì)照藥物效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ASⅣ減少慢性心力衰竭大鼠心肌凋亡率，抑制心肌纖維化，可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活化，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用。

綜上所述，ASⅣ能夠改善慢性心力衰竭大鼠心肌功能，減少心肌纖維化，降低心肌細(xì)胞凋亡率，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，其可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路發(fā)揮作用，為臨床治療慢性心力衰竭提供一定的理論依據(jù)。