曹新福，李 享，劉紅旭，周明學(xué)，2

快速性心律失常是一種常見(jiàn)的心律失常，包括頻發(fā)房性期前收縮、頻發(fā)室性期前收縮、房性心動(dòng)過(guò)速、室性心動(dòng)過(guò)速、室上性心動(dòng)過(guò)速、心房撲動(dòng)、心房顫動(dòng)等。中國(guó)大陸室性心律失常的年猝死總?cè)藬?shù)達(dá)54.5萬(wàn)人[1-2]。目前西醫(yī)治療快速性心律失常的方法主要包括以鈉通道阻滯劑、β受體阻滯劑、鉀通道阻滯劑、非二氫吡啶類(lèi)鈣拮抗劑等為主的藥物治療，以及以射頻消融術(shù)和埋藏式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器植入術(shù)等為主的非藥物治療，抗心律失常藥物不良反應(yīng)較大，且多有致心律失常的副作用，在一定程度上限制了其使用，器械治療有創(chuàng)且價(jià)格昂貴，病人不易接受?？焖傩孕穆墒С僦嗅t(yī)學(xué)“心悸”“怔忡”范疇，國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)魏執(zhí)真教授提出了快速性心律失常關(guān)鍵病機(jī)為“瘀熱”，治療上首創(chuàng)涼血清熱法，臨證時(shí)重用丹皮、赤芍、黃連，在快速性心律失常的治療上效果顯著[3-5]，同時(shí)有多項(xiàng)研究表明丹皮-赤芍-黃連具有明確的抗實(shí)驗(yàn)性快速性心律失常作用[6-7]，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。本研究嘗試從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探尋涼血清熱藥組丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物成分及靶點(diǎn)的篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)，網(wǎng)址：http://tcmspw.com/，分別以丹皮、赤芍、黃連為關(guān)鍵詞檢索出所有化合物成分，以口服生物利用度(OB)≥30%、類(lèi)藥性(DL)≥0.18作為篩選條件，篩選化合物成分，另外結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)于未能入選，但是文獻(xiàn)報(bào)道有生物活性和藥理作用的也納入候選化學(xué)成分，并依托TCMSP中的TargetsInfomation模塊篩選得到相應(yīng)成分的作用靶點(diǎn)。最后，應(yīng)用STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為其官方名稱(chēng)(official symbol)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集及藥物-疾病共同靶點(diǎn)篩選 以“Tachyarrhythmia”為關(guān)鍵詞通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，檢索與快速性心律失常相關(guān)的靶點(diǎn)，并將結(jié)果以EXCEL格式導(dǎo)出。將疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)輸入Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進(jìn)行交集，得到藥物-疾病之間的共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的疾病-藥物共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類(lèi)設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為>0.40，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病全局網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape(Version 3.7.1)軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，并將該網(wǎng)絡(luò)與得到的PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)Cytoscape的Merge功能合成全局性藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Cytoscape的附加功能CytoNCA計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度中心性(degree centrality，DC)、中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)，這4個(gè)參數(shù)是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的核心參數(shù)，值越大，說(shuō)明節(jié)點(diǎn)越接近網(wǎng)絡(luò)的中心，越有可能是關(guān)鍵靶點(diǎn)。采用4個(gè)核心參數(shù)分析并篩選丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因及基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析以及KEGG通路富集分析，并采用Omicshare軟件繪制KEGG富集分析條狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 丹皮-赤芍-黃連化學(xué)成分及靶點(diǎn)篩選 通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件，納入化學(xué)成分54個(gè)，有研究表明丹皮中丹皮酚(paeonol)含量較高且有明確的藥理作用[8]，故也納入候選成分，共得到化學(xué)成分55個(gè)，其中丹皮12個(gè)、赤芍29個(gè)、黃連14個(gè)，候選化學(xué)成分基本信息見(jiàn)表1。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索候選化學(xué)成分的靶點(diǎn)，共檢索到55個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的533個(gè)作用靶點(diǎn)，其中丹皮對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有267個(gè)，赤芍對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有158個(gè)，黃連對(duì)應(yīng)的點(diǎn)有161個(gè)，去重后共保留204個(gè)藥物靶點(diǎn)。應(yīng)用STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)輸入靶點(diǎn)名稱(chēng)并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為其官方名稱(chēng)(official symbol)。

表1 候選化學(xué)成分基本信息

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集及藥物-疾病共同靶點(diǎn)篩選 以“Tachyarrhythmia”為關(guān)鍵詞，檢索Gencards數(shù)據(jù)庫(kù)得到與疾病快速性心律失常相關(guān)的有治療作用的靶點(diǎn)共222個(gè)。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)輸入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖(見(jiàn)圖1)，并進(jìn)行交集，得到藥物-疾病之間的共同靶點(diǎn)共16個(gè)，16個(gè)靶點(diǎn)信息詳見(jiàn)表2。

表2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將16個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見(jiàn)圖2。圖中節(jié)點(diǎn)表示每個(gè)靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的直線代表靶點(diǎn)間有相互作用關(guān)系，每種顏色的線條分別代表不同關(guān)系，線條越多代表作用關(guān)系越強(qiáng)。

圖2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病全局網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，可得到網(wǎng)絡(luò)A，采用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可得到網(wǎng)絡(luò)圖B，利用Cytoscape軟件中的Merge功能，將網(wǎng)絡(luò)A和網(wǎng)絡(luò)B進(jìn)行合并，得到藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病全局網(wǎng)絡(luò)C，詳見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表藥物、成分、靶點(diǎn)、疾病，邊代表藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病之間的相互作用。采用CytoNCA計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的 DC、BC、CC和EC值，靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見(jiàn)表3，得到網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)DC中位數(shù)為13.5，度值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)有NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6、ADRA1B、GJA1、TGFB1，說(shuō)明這些靶點(diǎn)可能是丹皮-赤芍-黃連干預(yù)快速性心律失常的核心靶點(diǎn)。由圖3可知，與16個(gè)共同靶點(diǎn)有相互作用關(guān)系的藥物成分共有14個(gè)，這些成分可能為丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的關(guān)鍵成分，詳見(jiàn)表4。其中丹皮中有3個(gè)，分別為quercetin、kaempferol、paeonol；赤芍中有3個(gè)，分別為beta-sitosterol、paeoniflorin、Stigmasterol；黃連中有8個(gè)，分別為(R)-Canadine、coptisine、Berlambine、berberine、epiberberine、Worenine、palmatine、berberrubine。

表3 全局網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

表4 與共同靶點(diǎn)有相互作用關(guān)系的藥物成分

圖3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病全局網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)P<0.05，共收集到48個(gè)生物過(guò)程(BP)、10個(gè)細(xì)胞組分(CC)、8個(gè)分子功能(MF)，詳見(jiàn)表5～表7。生物過(guò)程主要涉及心室肌細(xì)胞膜復(fù)極的調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶激活、腎上腺素能受體信號(hào)通路、鈉離子輸運(yùn)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)控、MAPK級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、蛋白激酶B信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)控、去甲腎上腺素對(duì)血管舒張的調(diào)節(jié)作用、心室肌細(xì)胞膜去極化的調(diào)節(jié)、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、心房肌細(xì)胞膜去極化的調(diào)控、心房心肌細(xì)胞動(dòng)作電位等。細(xì)胞組分主要涉及質(zhì)膜、突觸后膜、軸突、細(xì)胞外基質(zhì)、軸突終末、側(cè)質(zhì)膜等。分子功能主要涉及支架蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、去甲腎上腺素結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合、蛋白質(zhì)均聚活性、離子通道活性等。

表5 GO富集-生物過(guò)程

表6 GO富集-細(xì)胞組分

表7 GO富集-分子功能

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)P<0.05，共收集到13條信號(hào)通路，詳見(jiàn)表8。以P-adjust值進(jìn)行排序，并繪制柱狀圖，詳見(jiàn)圖4。其中與快速性心律失常相關(guān)度較高的通路有3條，分別為cGMP-PKG信號(hào)通路(NOS3/ADRB2/ADRB1/ADRA1B/OPRD1)、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(SCN5A/ADRB2/ADRB1/ADRA1B)、鈣信號(hào)通路(NOS3/ADRB2/ADRB1/CHRM3/ADRA1B)。

表8 KEGG通路富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

3 討 論

中醫(yī)理論建立在系統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法論基礎(chǔ)上， 單一的成分或作用靶點(diǎn)研究難以充分揭示中藥復(fù)方的作用機(jī)制，而基于生物信息學(xué)基礎(chǔ)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘中藥復(fù)方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制，超越了單靶點(diǎn)思想的束縛，從多靶點(diǎn)的研究策略出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)闡述復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多作用機(jī)制的特點(diǎn)，從整體角度評(píng)價(jià)復(fù)方作用機(jī)制，其理念與中醫(yī)學(xué)的整體觀基本一致[9]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質(zhì)成分、潛在靶點(diǎn)及可能信號(hào)通路進(jìn)行了初步探尋。藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病全局網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的關(guān)鍵成分共有14個(gè)，黃連中有8個(gè)，丹皮、赤芍各有3個(gè)。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，其中具有較明確抗快速性心律失常作用的成分有4個(gè)，分別為丹皮酚(丹皮)、槲皮素(丹皮)、芍藥苷(赤芍)、小檗堿(黃連)。丹皮酚可阻斷SD大鼠心肌細(xì)胞的鈣通道，減少鈣離子內(nèi)流，降低心肌興奮性，進(jìn)而抑制烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常[10]；槲皮素能延長(zhǎng)氯化鈣誘發(fā)大鼠心律失常出現(xiàn)的時(shí)間，縮短心律失常持續(xù)時(shí)間，減少心律失常發(fā)生率及死亡率[11]；芍藥苷可能通過(guò)阻斷L型鈣電流(ICa，L)，內(nèi)向整流鉀電流和鈉電流，降低心室復(fù)極離散度，防止折返的形成，發(fā)揮抗心律失常作用[12]；歐陽(yáng)松等[13]研究表明，小檗堿可能通過(guò)抑制延遲整流鉀電流、乙酰膽堿調(diào)節(jié)的鉀電流，延長(zhǎng)心房肌場(chǎng)電位時(shí)程(fAPD)，加快興奮傳導(dǎo)速度(ECV)，延長(zhǎng)心房肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程(APD)及有效不應(yīng)期(ERP)，從而發(fā)揮抗心房顫動(dòng)作用。

藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病全局網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6、ADRA1B、GJA1、TGFB1等為丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，提示與快速性心律失常關(guān)系較密切的靶點(diǎn)有5個(gè)，分別為NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6。NOS3信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)調(diào)節(jié)L型Ca2+通道，降低鈣電流(ICa)抑制β腎上腺素能受體反應(yīng)，縮短APD，從而起到抗心律失常作用[14]。KCNH2編碼的電壓門(mén)控鉀通道的α亞基，該通道介導(dǎo)心臟中延遲整流鉀電流的快速激活成分(IKr)，是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位3期快速?gòu)?fù)極的主要電流，KCNH2基因突變與長(zhǎng)QT依賴(lài)的扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(TdP)和心室纖顫(VF)相關(guān)[15]。SCN5A基因編碼NAv1.5通道蛋白，該蛋白作為心臟電壓門(mén)控鈉離子通道的成孔α亞基，對(duì)于心房和心室動(dòng)作電位的啟動(dòng)和傳播至關(guān)重要[16]，SCN5A功能獲得性突變不僅降低電流密度，也呈現(xiàn)出持續(xù)的晩鈉電流，持續(xù)的晩鈉電流擾亂心房肌細(xì)胞復(fù)極化，延長(zhǎng)動(dòng)作電位，從而誘發(fā)包括心房顫動(dòng)及室性心律失常等[17]。ADRB2基因編碼β2腎上腺素能受體，該受體在蒲肯野纖維和竇房結(jié)有較高的分布，主要作用是通過(guò)影響鉀、鈣離子通道電流參與心律調(diào)節(jié)[18]。炎癥在心房顫動(dòng)的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中扮演了重要角色，炎性因子IL6參與了心房顫動(dòng)的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，炎性因子的水平變化與心房顫動(dòng)預(yù)后相關(guān)[19]。

GO功能富集顯示，丹皮-赤芍-黃連對(duì)快速性心律失常作用靶點(diǎn)包含48個(gè)生物過(guò)程、10個(gè)細(xì)胞組分、8個(gè)分子功能。主要體現(xiàn)在心肌細(xì)胞膜去極、復(fù)極的調(diào)節(jié)，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，離子通道活性，受體結(jié)合等方面。KEGG通路富集分析結(jié)果中與快速性心律失常相關(guān)的通路有3條，分別為cGMP-PKG信號(hào)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號(hào)通路等。其中，cGMP-PKG信號(hào)通路中cGMP是第二使者，介導(dǎo)一氧化氮(NO)的作用，其主要效應(yīng)子之一是cGMP依賴(lài)性蛋白激酶(PKG)，其催化包括CaV1.2等離子通道在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)磷酸化，導(dǎo)致蛋白活性或功能發(fā)生變化，而離子通道的活性和功能變化與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[20]。心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要涉及α和β腎上腺素能受體，通過(guò)α和β受體影響ICa，L、IKr、延遲整流鉀電流的慢成分(IKs)、內(nèi)向整流鉀電流(IK1)等電流，影響心室肌復(fù)極化過(guò)程，從而影響心律失常的發(fā)生與發(fā)展，其中α受體主要的調(diào)節(jié)途徑包括通過(guò)G蛋白偶聯(lián)磷脂酶C(PLC)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜磷酯(PIP2)代謝導(dǎo)致的抑制作用，影響最明顯的是對(duì)KCNQ1、hERG和Kir2通道，分別導(dǎo)致IKs、IKr、IK1電流抑制；β受體在心室肌上主要為β1亞型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，并由cAMP-PKA磷酸化途徑介導(dǎo)了ICa，L和IKs電流增強(qiáng)效應(yīng)[21]。鈣信號(hào)通路受β腎上腺素及α1腎上腺素的調(diào)節(jié)，β腎上腺素能受體激活后能通過(guò)激活電壓門(mén)控型鈣通道和受體門(mén)控型鈣通道的開(kāi)放，促進(jìn)胞外Ca2+內(nèi)流，而α1腎上腺素能受體可以激活PLC介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，水解磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，生成二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3配體門(mén)鈣通道結(jié)合，開(kāi)啟鈣通道，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活包括鈣調(diào)蛋白(CaM)在內(nèi)的各類(lèi)依賴(lài)鈣離子的蛋白，調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，當(dāng)CaM表達(dá)異常時(shí)易出現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起瞬時(shí)內(nèi)向電流導(dǎo)致延遲后除極，是自律性心律失常的重要發(fā)病機(jī)制[22-23]。

本研究提示槲皮素、丹皮酚、芍藥苷、小檗堿等可能為丹皮、赤芍、黃連發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分，其通過(guò)作用于NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6等靶點(diǎn)，影響多種離子通道活性和心肌細(xì)胞膜的去極、復(fù)極以及cGMP-PKG信號(hào)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和鈣信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗心律失常作用。本研究初步揭示了丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的可能成分、潛在靶點(diǎn)以及信號(hào)通路，為后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展涼血清熱藥組丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制相關(guān)研究提供了新的思路。