張麗華,張子洋,王子睿,姜彥君,蘇 靜,李丕武,范 翰,王瑞明,汪俊卿

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院,生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250353

中鏈脂肪酸(MCFAs)通常是指由8～10個(gè)碳原子組成碳鏈的脂肪酸,MCFAs廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)藥、食品及化妝品等相關(guān)行業(yè)[1],MCFAs衍生物可作為合成具有高耐水性、耐用性的生物塑料等聚合物的原材料[2-3],是非常理想的生物可降解材料?？梢杂糜谡{(diào)節(jié)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝、提高畜產(chǎn)品品質(zhì)、降低畜產(chǎn)品微生物污染[4]；可以作為添加劑在化妝品中發(fā)揮抗氧化的作用等[5]。目前脂肪酸及其衍生化合物的工業(yè)生產(chǎn)主要是基于植物油或動(dòng)物脂肪中提取,或基于石化合成路線(xiàn)[6]?；Y源的過(guò)度使用以及化學(xué)合成方法對(duì)環(huán)境問(wèn)題有很大影響,人們將目光轉(zhuǎn)向通過(guò)微生物生物合成生產(chǎn)中鏈脂肪酸[7]。

10-羥基-2-癸烯酸又稱(chēng)10-HDA,是蜂王酸中特有的一種既含雙鍵又含不飽和鍵的中鏈脂肪酸衍生物。分子式為C10H18O3,常溫下是白色粉末狀晶體,性質(zhì)非常穩(wěn)定,研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖等重要生理功能,但由于其提取困難,合成復(fù)雜,一直未能規(guī)?；a(chǎn),嚴(yán)重制約其下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。

探索生物合成10-HDA一直為各界學(xué)者所關(guān)注,目前研究發(fā)現(xiàn)至少要經(jīng)過(guò)脫氫形成雙鍵和對(duì)碳鏈末端進(jìn)行ω端氧化形成羥基兩個(gè)過(guò)程能合成10-HDA,本課題組研究發(fā)現(xiàn)癸烯酸是重要合成中間物質(zhì)[9],雖然在大腸桿菌中已初步探索出合成途徑,但由于細(xì)菌對(duì)10-HDA有抑制作用,一直沒(méi)能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量突破,已知巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)易于培養(yǎng)操作,高密度發(fā)酵水平很高,產(chǎn)物易提純,表達(dá)菌株穩(wěn)定。利用代謝工程改造酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸也比較成熟[10]。畢赤酵母屬于甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母,能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)畢赤酵母沒(méi)有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒,所以一般用整合型(YIp)載體作為外源基因的表達(dá)載體[11]。

因此我們也選擇畢赤酵母GS115作為表達(dá)細(xì)胞。另外,硫酯酶能催化水解脂酰-ACP和飽和脂肪脂酰鏈[12],生物體內(nèi)的長(zhǎng)鏈脂肪酸分解經(jīng)過(guò)β氧化不斷縮短碳鏈長(zhǎng)度,產(chǎn)生的短鏈脂肪酸產(chǎn)物需要及時(shí)從循環(huán)中釋放出來(lái),脂酰輔酶A硫酯酶(acyl-CoA thioesterase)是β氧化途徑輔助酶的一種,在生物體內(nèi)就發(fā)揮著這樣的作用[13],所以,硫酯酶對(duì)中鏈脂肪酸的積累起著關(guān)鍵作用。我們?cè)贕S115的基因組上整合來(lái)源大腸桿菌(Escherichiacoli)的硫酯酶和過(guò)氧化酶體中的脫氫酶基因,進(jìn)行基因改造,利用宿主酵母高蛋白表達(dá)率、傳代速度快以及發(fā)酵周期短、代謝可控的雙重優(yōu)點(diǎn)[14],以期獲得穩(wěn)定、高產(chǎn)、易收集的胞外游離不飽和中鏈脂肪酸的重組菌,進(jìn)而探索一種安全、無(wú)毒害MCFAs的生產(chǎn)新方法,也利于后面合成像10-HDA等高價(jià)值的不飽和羥基脂肪酸的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

大腸桿菌、熱帶假絲酵母菌種、畢赤酵母(P.pastoris)GS115菌種保藏于生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a購(gòu)自諾唯贊公司,質(zhì)粒載體pGAPZaA購(gòu)自淼靈生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)所涉及引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用LBG培養(yǎng)基:葡萄糖0.5%,蛋白胨1%,酵母浸粉0.5%,氯化鈉1%,pH 7.0～7.4。添加25 mg/L的卡那霉素用于質(zhì)粒維持。

YPD固體培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸粉1%,瓊脂糖2%,添加100 mg/ml的Zeocin篩選目的菌株。

電轉(zhuǎn)緩沖液:山梨醇1 M。

菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基:酵母浸粉1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸粉1%,癸酸2%,添加100 mg/ml的Zeocin用于目的菌株維持。

以上培養(yǎng)基均需在高壓蒸汽滅菌鍋中115 ℃滅菌 20 min。

1.1.3 試劑

限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、柱式DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司,葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨(均為生化試劑)購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的片段的獲取

提取大腸桿菌(E.coli)和熱帶假絲酵母(C.tropicalis)的基因組,從NCBI中的YdiI、FadA基因序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR技術(shù)分別以YdiI-F,YdiI-R為引物、E.coli基因組為模板獲得目的基因YdiI；以FadA-F,FadA-R為引物、C.tropicalis基因組為模板獲得目的基因FadA。

1.2.2 整合型質(zhì)粒pGAPZaA-Ydil-FadA的構(gòu)建

對(duì)質(zhì)粒pGAPZaA用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、KpnI進(jìn)行雙酶切,用T4-DNA連接酶連接有相同末端的Ydil基因；同樣對(duì)質(zhì)粒pGAPZaA用限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、NotI進(jìn)行雙酶切,用T4-DNA連接酶連接有相同末端的FadA基因。其中線(xiàn)性化克隆載體、目的片段分別添加2 μL,加入2 μL 10x T4 DNA Ligase buffer和1 μL Thermo Scientific T4 DNA Ligase,補(bǔ)加ddH2O至20 μL使用移液槍上下輕輕吹打混勻,于22 ℃反應(yīng)10 min。待反應(yīng)完成后,用柱純化試劑盒進(jìn)行純化,接下來(lái)進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化過(guò)程如下:將從-80 ℃冰箱取出的感受態(tài)細(xì)胞置于裝有冰的冰盒中(5～10 min),將10 μL DNA加入感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕搖動(dòng)并在冰上孵育30 min,將管置于42 ℃水浴中,經(jīng)過(guò)42 s精確熱沖擊后立即置于冰水浴中并靜置2 min,向小管中加入500 μL LB培養(yǎng)基,然后在37 ℃,200 r/min下孵育1 h,使細(xì)胞復(fù)蘇,移取200 μL至涂有Zeocin抗性的平板。放置于37 ℃中培養(yǎng)12～14 h。挑取平板上的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃培養(yǎng)至混濁。通過(guò)質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,至此獲得整合型質(zhì)粒pGAPZaA-Ydil-FadA。

1.2.3 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取酵母單菌落,接種至含有5 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL離心管中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL的培養(yǎng)物接種至含有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中,30 ℃、300 r/min培養(yǎng)3 h,至OD560達(dá)到1.3～1.5。將細(xì)胞培養(yǎng)物倒入到一個(gè)無(wú)菌用冰水預(yù)冷50 mL的聚丙烯管,于4 ℃,5 000 r/min離心5 min,吸取20 mL的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸,離心去上清,再次用5 mL冰預(yù)冷的1 M山梨醇溶液將菌體沉淀重懸,離心去上清,最后用1 mL的冰預(yù)冷的1 M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸,重懸液按每管100 μL分裝到滅菌的EP管中冷凍保存。

1.2.4 重組酵母工程菌GS115-pGAPZaA-Ydil-FadA的構(gòu)建

提取質(zhì)粒pGAPZaA-Ydil-FadA,用限制性?xún)?nèi)切酶AvrII將其線(xiàn)性化,并純化回收,用乙醇沉淀法濃縮質(zhì)粒到質(zhì)粒濃度為100 μg/μL。加入到100 μL的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,冰浴 5 min后移入冰冷的電轉(zhuǎn)杯中,1 500 V電擊5 ms,結(jié)束后加入600 μL冰預(yù)冷的山梨醇溶液和菌體混勻,轉(zhuǎn)至1.5 mL的EP管中,30 ℃孵育1 h。將菌體懸液涂布于含Zeocin的YPD平板上,30 ℃條件下培養(yǎng)3～4 d至有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出[15]。

1.2.5 陽(yáng)性重組子的篩選與鑒定

挑取Zeocin抗性平板上生長(zhǎng)出的單菌落,接種于液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)起來(lái),提取其基因組作為模板DNA,以設(shè)計(jì)好的抗性引物Zeocin-F、Zeocin-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)

取活化后重組酵母菌的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝液量為100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,接種量為5%,30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng),每隔12 h取樣1 mL并標(biāo)號(hào),取樣至72 h。

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)果分析

將標(biāo)準(zhǔn)品癸酸、癸烯酸分別配置濃度為0.5 g/L、0.250 g/L、0.125 g/L、0.062 5 g/L,作為標(biāo)樣與每隔12 h取得發(fā)酵液樣品,先進(jìn)行硅烷化處理再進(jìn)行氣質(zhì)分析。將1 mL發(fā)酵液轉(zhuǎn)入2 mL離心管,沸水中煮沸15 min,立即放入-20 ℃環(huán)境中15 min。然后加入1 mL乙酸乙酯振蕩混勻,靜置一會(huì),9 000 r/min離心8 min,將上層有機(jī)相吸取于新的1.5 mL管中(注意不要吸到下層菌液),向上部有機(jī)相中加入150 μL NO-雙(三甲基硅烷基)三氯乙酰胺,使用一次性注射器及0.22 μm的有機(jī)濾膜將樣品打入氣相瓶中,進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)動(dòng)分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲取目的片段

用提取的大腸桿菌基因組作為模板,以YdiI-F,YdiI-R為上下游引物進(jìn)行PCR,并將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。同樣用提取的熱帶假絲酵母基因組作為模板,以FadA-F,FadA-R為上下游引物進(jìn)行PCR,將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示。在圖中均出現(xiàn)了目的條帶,且條帶單一,證明基因YdiI、FadA擴(kuò)增成功且引物特異性較好。

注:M為DL5000 Marker；1～2泳道為YdiI基因,長(zhǎng)774 bp

注:M為DL5000 Marker；1～2泳道為FadA基因,長(zhǎng)1 986 bp

2.2 整合型質(zhì)粒pGAPZaA-Ydil -FadA的構(gòu)建與鑒定

對(duì)質(zhì)粒pGAPZaA分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、KpnI和XhoI、NotI進(jìn)行雙酶切,與有相同末端的Ydil、FadA基因進(jìn)行連接,質(zhì)粒重構(gòu)過(guò)程如圖3。

圖3 質(zhì)粒構(gòu)建圖

連接好的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中,經(jīng)抗性篩選出陽(yáng)性重組菌,提取質(zhì)粒。將提取的pGAPZaA-Ydil-FadA質(zhì)粒用ArvII限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化,通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證,引物為pyf-F、pyf-R,獲得結(jié)果見(jiàn)圖4，條帶對(duì)應(yīng)高度為6 000 bp以上,與理論值6 400 bp相符,證明質(zhì)粒構(gòu)建成功,并且提取和酶切正確。

注:M為DL10000 Marker；1～3泳道為重組質(zhì)粒pGAPZaA-liu -CoAo,長(zhǎng)6 400 bp

2.3 重組菌株的構(gòu)建

將上步獲得的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)中,涂布在含Zeocin抗性的平板上,3 d后單菌落長(zhǎng)出,挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中活化,并提取酵母基因組,以其為模板,以Zeocin-F和Zeocin-R為引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后驗(yàn)證其特異性條帶的大小,結(jié)果如圖5,證明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入GS115中。

注:M為DL5000 Marker；1～4泳道為zeocin片段,長(zhǎng)375 bp

2.4 重組工程菌GS115-pGAPZaA-Ydil -FadA發(fā)酵結(jié)果

將獲得的工程菌GS115-pGAPZaA-Ydil-FadA進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),同時(shí)每隔12 h取樣,并做氣質(zhì)聯(lián)用分析,結(jié)果如圖6,檢測(cè)到目的產(chǎn)物2-癸烯酸。證明硫酯酶及脫氫酶在P.pastorisGS115中成功表達(dá),但分析產(chǎn)物產(chǎn)量發(fā)現(xiàn),在24 h達(dá)到最高為33.7 mg/L,結(jié)果見(jiàn)圖7。36 h及之后并未檢測(cè)出2-癸烯酸存在,這可能是由于P.pastorisGS115中存在能夠代謝2-癸烯酸的途徑,2-癸烯酸在發(fā)酵后期作為碳源通過(guò)脂肪酸代謝過(guò)程被重新利用。

圖6 氣質(zhì)檢測(cè)圖

圖7 不同時(shí)間對(duì)癸烯酸產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論與展望

本研究對(duì)畢赤酵母現(xiàn)有基因表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了探究與改進(jìn),在此基礎(chǔ)上于畢赤酵母中重新構(gòu)建生物合成2-癸烯酸的代謝途徑。利用畢赤酵母GS115為宿主細(xì)胞,以癸酸為底物,發(fā)酵生產(chǎn)癸烯酸。研究了畢赤酵母菌中脂肪酸氧化積累途徑中的關(guān)鍵酶——硫酯酶、脫氫酶,發(fā)現(xiàn)硫酯酶和脫氫酶可以在畢赤酵母中正常表達(dá),在合成不飽和脂肪酸代謝途徑中發(fā)揮重要作用,在此基礎(chǔ)上,我們將繼續(xù)探索提高硫酯酶的活力,將其在畢赤酵母中高效表達(dá),最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)為今后利用畢赤酵母為工程菌生產(chǎn)2-癸烯酸甚至是中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[17],實(shí)現(xiàn)了中鏈脂肪酸在畢赤酵母中的異源合成。目前,其他探索像在大腸桿菌中合成中鏈脂肪酸等[18-19]使得生物法合成羥基脂肪酸有了較為深入的研究[20],本文則助力于深入了解畢赤酵母的特異鏈長(zhǎng)脂肪酸調(diào)控機(jī)制,為微生物高效合成各類(lèi)鏈長(zhǎng)脂肪酸及其衍生物提供重要的理論參考。有望將生物合成癸烯酸應(yīng)用于工業(yè),顯著提高其應(yīng)用價(jià)值。