李單單

河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗區(qū)服務(wù)中心 河南漯河 462000

臘肉是湖北、四川、湖南、江西、云南、貴州、甘肅隴西、陜西的特產(chǎn)，已有幾千年的歷史。其基本做法是將一定比例的食鹽和多種香辛料混合放在肉中進(jìn)行腌制7～15d，然后把肉串掛起來，把水滴干，再用柏樹枝、甘蔗皮、椿樹皮或柴草火熏烤，隨后掛起來用煙火慢慢熏干而成。煙熏的主要目的是賦予臘肉特有的色澤和風(fēng)味。但在高溫條件下熏材的不完全燃燒會產(chǎn)生一種致癌性較強的化學(xué)物質(zhì)苯并芘，煙熏溫度越高，產(chǎn)生的致癌物就越多。

苯并芘(Benzopyrene)是一種含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，在環(huán)境中廣泛存在[1]。苯環(huán)的稠合位置不同，苯并芘分為2種，苯并[a]芘(1，2-苯并芘)和苯并[e]芘(4，5-苯并芘)。常見的是苯并[a]芘，英文縮寫B(tài)[a]P，CAS號為50-32-8，化學(xué)式為C20H12，分子量為252.31。常溫下狀態(tài)為黃色粉末，熔點為179℃，溶解度方面難溶于水，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、二甲苯、丙酮、乙醚、氯仿、二甲基亞砜等有機溶劑。最初由煤焦油中分離得到，從煤煙、焦油、瀝青、香煙煙霧中都可以查出，有強烈的致癌作用，可以誘發(fā)肺癌，其在大氣中的含量已經(jīng)列入環(huán)境監(jiān)測的常規(guī)項目[2]。動物實驗證明，苯并芘具有致癌、致畸和致突變型，其在食品、油脂、水體和土壤中廣泛存在。4，5-苯并芘(苯并[e]芘)是1，2-苯并芘的同分異構(gòu)體，存在于煤煙和焦油中。苯并芘在工業(yè)上無生產(chǎn)和使用價值，一般只作為生產(chǎn)過程中形成的副產(chǎn)物隨廢氣排放。最早于1933年，英國科學(xué)家J.W.Cook等人從瀝青中分離得到苯并芘純品，合成證明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行動物實驗，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了皮膚癌，由此，苯并芘被確認(rèn)為是第一個化學(xué)環(huán)境致癌物[3]。

目前針對苯并芘的測定，相關(guān)文獻(xiàn)中多采用酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]、膠體金法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、液相色譜-熒光檢測法等[8～16]。采用食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并[a]芘的測定》中的液相色譜法測定苯并[a]芘時，由于臘肉的油脂多且成分復(fù)雜，苯并[a]芘的加標(biāo)回收率低、且結(jié)果不好重現(xiàn)，因此需要建立一種有效快速測定臘肉中苯并[a]芘含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀Waters Acquity Arc，美國沃特世科技有限公司，配waters2475熒光檢測器；

色譜柱Cortecs-C18(4.6×50mm，2.7μm)；

固相萃取柱BaP-2，月旭科技；

固相萃取柱Silica，月旭科技；

固相萃取儀，美國安捷倫科技有限公司；

電子分析天平ML204T，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

氮氣發(fā)生器LCMS30-1-E，英國Parker；

氮吹儀N-EVAP 24，美國Organomation；

多位渦旋振蕩器，廣東晉元；

超聲波清洗器，中國昆山舒美；

有機濾膜0.22μm，天津津騰公司。

1.2 試劑

分析純二氯甲烷，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

分析純正己烷，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

色譜純乙腈，上海安譜實驗科技股份有限公司；

實驗用水為Milli-Q Advantage A10超純水，美國Millipore公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

苯并芘，純度99.6%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

準(zhǔn)確稱取一定量的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容至100mL，配制成1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液

吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈+水=90+10稀釋成濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后經(jīng)過逐級稀釋，用乙腈+水=90+10配制成濃度分別為0.4、1、2、4、8ng/mL的系列工作溶液。

1.4 樣品前處理過程

1.4.1 樣品提取

稱取5g(精確至0.001g)已粉碎均勻的樣品于50mL離心管中，加入10mL正己烷渦旋混合10min，40℃下超聲提取10min，以6 000r/min轉(zhuǎn)速于4℃冷凍離心5min，轉(zhuǎn)移出上清液，再加入10mL正己烷重復(fù)提取一次。合并上清液待凈化。

1.4.2 凈化

依次用5mL二氯甲烷、5mL正己烷活化Silica-BaP-2串聯(lián)柱，加入待凈化液16mL，棄去全部流出液；加入5mL正己烷淋洗整個串聯(lián)柱，然后棄去上面Silica硅膠柱，用5mL正己烷淋洗下面BaP-2柱，然后加入6mL二氯甲烷洗脫液，收集洗脫液并抽干，在洗脫液中加入0.5mL乙腈，40℃下氮吹至近干。然后用乙腈+水=90+10定容至1mL，供上機檢測。

1.4.3 儀器條件

色譜柱：Cortecs-C18(4.6×50mm，2.7μm)。

流動相：乙腈+水=90+10。

流速：0.5mL/min。

柱溫：35℃。

進(jìn)樣量：10μL。

檢測波長：激發(fā)384nm，發(fā)射406nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗考察了C18色譜柱規(guī)格分別為(4.6×250mm,5μm)、(4.6×50mm，2.7μm)時對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：在使用第一種色譜柱時，柱壓較高，保留時間為16min，不利于樣品的批量快速測定；在使用第二種色譜柱時，不僅能滿足實驗要求，且保留時間較短(3min左右)，能大大節(jié)省檢測時間，因此試驗選擇C18色譜柱的規(guī)格為(4.6×50mm，2.7μm)。

試驗進(jìn)一步考察了標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品最后定容的溶劑對峰的影響。結(jié)果顯示：以純乙腈作為溶劑時，其峰高比流動相作為定容溶劑時低5%，純乙腈定容時會有溶劑效應(yīng)，因此最終的定容溶劑選擇和流動相一致。

同時試驗還考察了流動相中水和乙腈的比例分別為30∶70、20∶80、12∶88、10∶90、8∶92時對峰的影響。發(fā)現(xiàn)隨著水的比例減少，目標(biāo)峰出峰時間提前了，雖節(jié)省了檢測時間，但水的比例過低時，雜峰增加，目標(biāo)峰出現(xiàn)拖尾，且響應(yīng)值降低。綜合考慮，試驗最終選擇10∶90作為流動相。

按照1.4優(yōu)化的前處理及儀器條件對1ng/mL苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品加標(biāo)(2ng/g)進(jìn)行測定，得到的色譜圖見圖1。

圖1 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和樣品加標(biāo)(b)色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、1、2、4、8ng/mL，按照優(yōu)化好的色譜條件上機測定，得到各濃度點的色譜圖。

根據(jù)色譜圖，做出標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度X與峰面積Y之間的關(guān)系。結(jié)果表明，苯并芘在5min內(nèi)即可完成檢測，且在0.4～8ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=3.40×106+5.86×104，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，同時根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10確定目標(biāo)物的檢出限和定量限，苯并芘的檢出限為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg。苯并芘的各濃度點色譜圖、校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限分別見圖2和表1。

圖2 各濃度點標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(a)和校準(zhǔn)曲線(b)

表1 苯并芘的線性范圍，回歸方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限及定量限

2.3 精密度實驗

以苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液2ng/mL，按照1.4.3的儀器條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得苯并芘的保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.002%和0.03%。結(jié)果表明該實驗的色譜條件具有良好的精密度。

2.4 樣品的加標(biāo)回收率實驗

準(zhǔn)確稱取5g制備好的臘肉樣品，分別加入苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品1、5、10ng，每個加標(biāo)點做3個，按照1.4.1和1.4.2的方法進(jìn)行樣品前處理，然后按照1.4.3的方法進(jìn)行上機測定計算加標(biāo)回收率，測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，加標(biāo)平均回收率在87.86%～90.20%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0～1.3之間，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足臘肉中苯并芘含量的檢測要求。

表2 苯并芘的添加回收率、精密度(n=3)

2.5 實際樣品中苯并芘的測定

隨機從超市中購買10個品牌的臘肉，按照1.4的方法進(jìn)行前處理和上機測定。每個樣品稱3份，分別測定計算其平均值，測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明10份臘肉樣品中均含有不同量的苯并芘，但都不超限量(5μg/kg)。

表3 不同品牌臘肉中苯并芘的含量

3 討論

本試驗利用高效液相色譜法檢測臘肉樣品中的苯并芘，苯并芘的出峰時間早，節(jié)省檢測時間，分離度滿足試驗需求，既可以節(jié)省流動相中的乙腈，實用性強，又特別適合大批量樣品的檢測，可為今后臘肉中苯并芘的檢測提供可靠的數(shù)據(jù)支持。