夏九成 龍廷 秦達念

(1攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室)

腫瘤壞死因子(TNF)-α通常是由激活的免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生，對許多腫瘤細胞具有明顯的細胞毒性，可在特定動物模型中引起腫瘤的消退。通常，TNF-α被認為是促炎性因子誘導(dǎo)細胞凋亡〔1，2〕。但最近卻發(fā)現(xiàn)在特定病理及生理條件下，TNF-α的功能具有雙向性，即有時誘導(dǎo)細胞組織的壞死凋亡，有時則是促進組織細胞的再生〔3，4〕。組織和細胞的類型、TNF-α受體的構(gòu)成、TNF-α作用的時機及作用時間的長短都可以影響TNF-α在體內(nèi)的作用方向和結(jié)果。TNF-α的信號傳導(dǎo)依賴于細胞膜上兩個截然不同的受體發(fā)揮作用。分別是TNF受體(TNF-R)1(55 kD)和TNF-R2(75 kD)。TNF-R1在大多數(shù)組織細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，而TNF-R2主要在免疫組織和細胞內(nèi)進行可調(diào)控性表達。 在多數(shù)情況下，TNF-R1是主要的TNF-α信號介導(dǎo)因子，可以介導(dǎo)各類炎癥反應(yīng)，從而引起機體產(chǎn)生病變〔4～6〕。

NG108-15細胞株是一個由小鼠神經(jīng)母細胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞雜交后獲得細胞株系〔7〕。其中，小分子化合物雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(dc-AMP)可以誘導(dǎo)NG108-15細胞分化形成成熟的神經(jīng)元細胞。許多研究機構(gòu)均采用該細胞系作為細胞模型來研究神經(jīng)元的功能變化〔8，9〕。

本研究針對小鼠TNF-R1基因序列的不同區(qū)段，設(shè)計了4組候選sh-RNAi干擾序列試圖敲低TNF-R1在NG108-15細胞內(nèi)的表達，以確定最佳的sh-RNAi干擾序列〔10～14〕。并研究sh-RNAi干擾序列對NG108-15細胞內(nèi)的阿黑皮素原(POMC)、神經(jīng)肽(NP)Y、刺鼠基因相關(guān)蛋白(AGRP)神經(jīng)內(nèi)分泌基因是否存在干擾〔15，16〕。

1 材料與方法

1.1實驗材料 NG108-15細胞系，PIPZ-1質(zhì)粒載體，DH5a大腸桿菌。

1.2實驗試劑與藥品 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素，Gibco),dc-AMP、氨芐霉素、嘌呤霉素(Sigma)，RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒(Takara)，Xhol和EcoR-1限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶(NEB)，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipo2000(Invitrgen)，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA分子marker(天根生物)，LB固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基，瓊脂糖，溴化乙錠，大腸桿菌感受態(tài)細胞制備試劑盒(生工)。

1.3實驗方法

1.3.1NG108-15細胞的分化培養(yǎng) 將NG108-15細胞按1×104細胞/ml密度接種到直徑為35 mm的細胞培養(yǎng)板上，加入1 ml DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后，加入含1 mmol/L dc-AMP的DMEM培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。此后每隔3 d換液一次，7 d后待細胞完全分化出細胞突觸后，收集所培養(yǎng)細胞待用。

1.3.2針對TNF-R1設(shè)計的sh-RNAi干擾序列 sh-RNAi干擾序列均根據(jù)小鼠TNF-R1基因的mRNA(NM_011609.4)，利用siDirect軟件來設(shè)計，sh-0為空白對照，空載質(zhì)粒；Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-4具體序列見表1。

表1 小鼠TNF-R1的sh-RNAi干擾序列

1.3.3sh-RNAi重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建 載體(PIPZ-1，圖1)由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院顧巍教授實驗室惠贈。將PIPZ-1質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌進行質(zhì)粒的擴增，并通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。將提取純化的質(zhì)粒，利用Xhol 和EcoR-1(NEB)限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，以保證干擾序列的定向插入。然后利用T4DNA將干擾序列連接到PIPZ-1載體上。

1.3.4sh-RNAi重組DNA轉(zhuǎn)入NG108-15細胞 當(dāng)NG108-15細胞生長密度達到70%～90%后，將重組sh-RNAi的載體分子利用Lipo2000(Invitrogen)將其轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)。利用5 μg/ml嘌呤霉素(Solarbio)篩選獲得轉(zhuǎn)化細胞。

1.3.5TNF-R1基因表達的熒光定量檢測 用100 pg/ml TNF-α孵育轉(zhuǎn)化細胞12 h后，收集每一個培養(yǎng)孔中的轉(zhuǎn)化細胞，加入0.5 ml的RNA提取試劑(Takara)提取總RNA，用50 μl超純水稀釋后-70℃保存。cDNA的合成利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)完成，之后的PCR在熒光定量PCR儀(ABI7500)上進行，擴增程序為95℃，5 s；60℃，34 s；40個循環(huán)，擴增試劑為SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara)。擴增引物序列見表2，試驗結(jié)果用2-ΔΔCt相對定量法進行數(shù)據(jù)分析。

圖1 PIPZ-1載體的結(jié)構(gòu)(8 075 bp)

表2 熒光定量PCR的引物序列

1.3.6POMC、NPY、AGRP神經(jīng)內(nèi)分泌基因受干擾的檢測 在確認最佳的TNF-R1干擾系列后，將其導(dǎo)入成熟的NG108-15細胞中，利用熒光定量PCR檢測此干擾系列對神經(jīng)內(nèi)分泌基因POMC、NPY和AGRP是否存在干擾效應(yīng)?；蛞镄蛄幸姳?。

表3 POMC、NPY和AGRP基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1NG108-15細胞的誘導(dǎo)分化 NG108-15細胞出現(xiàn)分化，部分細胞間出現(xiàn)突觸聯(lián)系，說明具有了神經(jīng)元細胞的形態(tài)特征。見圖2。

圖2 NG108-15細胞的形態(tài)特征(×100)

2.2sh-RNAi干擾TNF-R1 Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-4、Sh-0干擾序列TNF-R1相對表達量分別為：0.445±0.32、0.679±0.14、0.834±0.41、0.561±0.26、1.000±0.24。Sh-1干擾序列對TNF-R1基因具有最好的干擾效果，可將其作為本試驗的最佳干擾序列進行后續(xù)的干擾試驗。

2.3Sh-1干擾序列對POMC、AGRP、NPY基因的表達影響 Sh-1干擾序列對POMC、AGRP和NPY基因的表達均有顯著影響，尤其對AGRP基因的影響最顯著(調(diào)低45.4%)。見表4。

表4 sh-1干擾序列對POMC、NPY和AGRP基因表達的影響

3 討 論

本研究根據(jù)小鼠TNF-R1基因的mRNA序列設(shè)計了4組sh-RNAi干擾序列導(dǎo)入分化后的NG108-15細胞。從干擾結(jié)果來看，sh-1的干擾結(jié)果最佳。而sh-1干擾序列針對的靶區(qū)是TNF-R1受體的439～461位，此序列是TNF-R1受體的膜外半胱氨酸富集區(qū)(CRD)1。該靶區(qū)對于TNF-α與受體TNF-R1的有效結(jié)合，并對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到關(guān)鍵作用〔4，6，10〕。同時Sh-1通過對TNF-R1的干擾，最終對下游的其他神經(jīng)內(nèi)分泌基因也可產(chǎn)生影響，使POMC、NPY和AGRP基因的表達也有不同程度降低。由此說明，對于由于細胞炎性因子TNF-α誘導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌疾病，可以考慮通過sh-RNAi干擾的方法降低相應(yīng)的炎癥反應(yīng)〔3，4，10，13〕。