郭金蘭 甘才斌 張潔 董明亮 馬新蘋

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院皮膚科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是一種起源于皮膚或其附屬物的惡性腫瘤，已嚴(yán)重威脅人類的健康〔1〕。目前，臨床主要采用手術(shù)、放療、化療和聯(lián)合治療等治療方法，但由于這些治療方法的局限性，并未產(chǎn)生理想的治療效果〔2〕。因此，尋找具有更好療效的新治療方法顯得至關(guān)重要。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的重要成員，研究〔3，4〕表明，miR-17-5p的異常表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，miR-17-5p在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)明顯上調(diào)，miR-17-5p可通過抑制其下游靶基因SOCS6促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖〔3〕；但miR-17-5p在三陰性乳腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-17-5p可通過靶向下調(diào)ETV1抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔4〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路與癌癥的相關(guān)性研究是近年來的研究熱點(diǎn)。已有研究〔5～7〕表明，miRNA通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤、宮頸癌和甲狀腺乳頭狀癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。例如，miR-489通過靶向spin1介導(dǎo)的PI3K/AKT通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡〔5〕；miR-383通過下調(diào)PARP2抑制PI3K-AKT-MTOR信號(hào)通路抑制宮頸癌的發(fā)生〔6〕；miRNA-148a通過STAT3和PI3K/AKT信號(hào)通路抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長〔7〕。但尚無miR-17-5p在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)研究，且miR-17-5p能否通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和凋亡也尚未可知。因此，本研究探討miR-17-5p靶向PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑、儀器 皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購自美國ATCC。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自賽默飛公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；Inhibitor-con、miR-17-5p inhibitor、WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1的構(gòu)建和測序由上海生工公司提供；RIPA試劑、噻唑藍(lán)(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western印跡相關(guān)試劑均購自北京索萊寶公司。兔抗PIK3R1、p-AKT、p-PI3K、cyclinD1、Bcl-2和Bax抗體購于美國Abcam公司，兔抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購于武漢博士德公司。胰島素樣生長因子(IGF)-1和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀購自美國ABI公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A431和HaCaT細(xì)胞。定期觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用胰酶消化進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長期的A431細(xì)胞，以細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度約為60%時(shí)，用LipofectamineTM2000將NC、Inhibitor-con和miR-17-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞。于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)分組如下：NC組，Inhibitor-con組、miR-17-5p inhibitor(轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor)組。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17-5p是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路來調(diào)控皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431的增殖和凋亡，當(dāng)A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor 48 h后，用100 ng/ml的IGF-1〔8〕處理1 h，隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)分為miR-17-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor)和miR-17-5p inhibitor+IGF-1組(轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor后，用IGF-1處理)。

1.3qRT-PCR檢測 利用TRIzol試劑從HaCaT細(xì)胞及各組A431細(xì)胞中提取總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。所有引物由北京華大基因提供。以U6作為miR-17-5p的內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：miR-17-5p上游引物：5′-CTCTTACAGTGCAGGTAGAAAA-3′，下游引物：5′-GAGC-AGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物：5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖活力 將對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，按照上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法向A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor或Inhibitor-con后，分別于轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)向每孔中加入MTT試劑20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)上清，向每孔中加入150 μl的DMSO，振蕩10 min至完全溶解，用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值(用空白孔進(jìn)行調(diào)零)。為了證明IGF-1可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響，分別在轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h后，用100 ng/ml的IGF-1處理1 h，然后按照上述步驟檢測細(xì)胞活力。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取各組A431細(xì)胞，用胰酶消化后離心，棄上清液，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞2次，加入適量的1×結(jié)合緩沖液輕輕吹打重懸細(xì)胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC進(jìn)行混勻，在室溫條件下避光孵育15 min后，加入5 μl的PI染色，隨后用流式細(xì)胞儀測定各組A431細(xì)胞的凋亡情況。

1.6Western印跡檢測 用RIPA細(xì)胞裂解液裂解各組A431細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，分別取30 μg各組細(xì)胞蛋白，煮沸5 min充分變性后，用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，當(dāng)電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用10%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Western印跡洗滌液充分洗滌(3次×10 min/次)，分別加入稀釋好的抗PIK3R1、β-actin、p-AKT、p-PI3K、細(xì)胞周期素(Cyclin)D1、Bax和Bcl-2蛋白的一抗4℃孵育過夜后，Western印跡洗滌液充分漂洗(3次×10 min/次)，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育膜1 h，Western印跡洗滌液充分漂洗(3次×10 min/次)后，用ECL試劑盒進(jìn)行顯色，利用灰度分析軟件Image J對(duì)目的條帶進(jìn)行分析(以β-actin為內(nèi)參)。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Target Scan (http：//www.targetscan.org)預(yù)測miR-17-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-17-5p的5′端可與PIK3R1的3′-UTR特異性結(jié)合，猜測PIK3R1是miR-17-5p的靶基因。為驗(yàn)證這一猜想，構(gòu)建野生型WT-PIK3R1和突變型MUT-PIK3R1的PIK3R1 3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-17-5p和miR-con分別與WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1共轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞，然后將各組A431細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒操作步驟對(duì)各組A431細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-17-5p在人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞中的表達(dá) 與HaCaT細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)量(0.81±0.12)比較，皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞中(3.45±0.41)表達(dá)顯著上調(diào)(t=10.704，P=0.000)。表明miR-17-5p在皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞中呈高表達(dá)，在人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中呈低表達(dá)。

2.2抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細(xì)胞中miR-17-5p的表達(dá)顯著降低(P<0.001)。表明成功構(gòu)建了抑制miR-17-5p表達(dá)的A431細(xì)胞株。與NC組和Inhibitor-con組相比，miR-17-5p inhibitor組A431細(xì)胞在0 h、24 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時(shí)A431細(xì)胞增殖活力顯著降低，CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著降低(均P<0.01)，見表1和圖1。提示抑制miR-17-5p表達(dá)可抑制A431細(xì)胞的增殖。

表1 抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響

1～3：NC組,Inhibitor-con組,miR-17-5p inhibitor組，圖2、4同圖1 Western印跡檢測抑制miR-17-5p表達(dá)后A431細(xì)胞CyclinD1的表達(dá)

2.3抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細(xì)胞的凋亡率顯著增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低(均P<0.001)。見圖2、表2。表明抑制miR-17-5p表達(dá)可促進(jìn)A431細(xì)胞凋亡。

圖2 Western印跡檢測抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響

表2 抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響

2.4miR-17-5p靶向調(diào)控PIK3R1的表達(dá) 圖3A結(jié)果顯示，miR-17-5p與WT-PIK3R1的3′UTR之間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。野生型PIK3R1基因熒光素酶表達(dá)載體WT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后，miR-17-5p組A431細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組明顯降低(P<0.01)；而突變型PIK3R1基因熒光素酶表達(dá)載體MUT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后，miR-17-5p組A431細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組差異不顯著(P>0.05)。見圖3B、表3。與mimic-con組A431細(xì)胞PIK3R1蛋白的表達(dá)量(0.76±0.14)比較，miR-17-5p mimic組(0.32±0.05)顯著減低；與inhibitor-con組A431細(xì)胞PIK3R1蛋白表達(dá)量(0.71±0.11)比較，miR-17-5p inhibitor組(1.32±0.19)顯著升高(P<0.05)。提示PIK3R1是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p可負(fù)性調(diào)控PIK3R1的表達(dá)。

1～4:mimic-con組，miR-17-5p mimic組，inhibitor-con組，miR-17-5p inhibitor組;A：通過TargetScan對(duì)miR-17-5p和結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖；B：Western印跡檢測PIK3R1蛋白表達(dá)圖3 miR-17-5p靶向調(diào)控PIK3R1的表達(dá)

表3 miR-con或miR-17-5p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路下游蛋白表達(dá)的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細(xì)胞中p-AKT和p-PI3K蛋白的表達(dá)顯著降低(均P<0.001)。見圖4，表4。表明抑制miR-17-5p表達(dá)可抑制A431細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路下游蛋白的表達(dá)。

圖4 Western印跡檢測p-AKT和p-PI3K蛋白的表達(dá)

表4 Western印跡檢測p-AKT和p-PI3K的蛋白表達(dá)

2.6PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑IGF-1可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用 與Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細(xì)胞在0 h、24 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時(shí)A431細(xì)胞增殖活力顯著降低，A431細(xì)胞凋亡率顯著升高，p-AKT和p-PI3K蛋白的表達(dá)顯著降低(均P<0.05)；與miR-17-5p inhibitor組比較，miR-17-5p inhibitor+IGF-1組A431細(xì)胞在0 h、24 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時(shí)A431細(xì)胞增殖活力顯著升高，A431細(xì)胞凋亡率顯著降低，p-AKT和p-PI3K蛋白的表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見圖5，表5，表6。以上結(jié)果表明，PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑IGF-1可逆轉(zhuǎn)抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。

1～3:Inhibitor-con組、miR-17-5p inhibitor組、miR-17-5p inhibitor+IGF-1組圖5 Western印跡檢測p-AKT、 p-PI3K蛋白表達(dá)

表5 IGF-1處理轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor的A431細(xì)胞增殖和凋亡情況

表6 Western印跡檢測p-AKT、 p-PI3K蛋白表達(dá)

3 討 論

miR-17-5p屬于miR-17家族，編碼基因位于人類13q31和嚙齒類14qE4染色體上，已有研究〔9～11〕發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在宮頸癌中高表達(dá)，通過靶向轉(zhuǎn)化生長因子β受體(TGFBR)2促進(jìn)宮頸癌的增殖和轉(zhuǎn)移；miR-17-5p還可通過靶向p21促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。然而，在前列腺癌中，miR-17-5p表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-17-5p可抑制癌細(xì)胞的生長和雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性。PI3K/AKT信號(hào)通路是惡性腫瘤中最活躍的信號(hào)通路之一，PI3K由一個(gè)催化亞基和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成，PIK3R1基因編碼的p85α是主要的調(diào)節(jié)亞基，p85α通過與催化亞基p110結(jié)合，抑制p110的催化活性，抑制PI3K/AKT通路的活化。PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因的異常表達(dá)是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的常見驅(qū)動(dòng)因素。研究〔12～14〕發(fā)現(xiàn)，多種miRNA通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。如miR-106b和miR-93通過PI3K/AKT通路抑制PTEN來調(diào)控乳腺癌的進(jìn)展〔12〕；miR-451通過下調(diào)PI3K/AKT通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞生長〔13〕；miR-497通過靶向胰島素樣生長因子1受體(IGFR)1可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的存活、增殖和侵襲〔14〕。但miR-17-5p和PI3K/AKT信號(hào)通路在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中作用尚不清楚。

PIK3R1的異常表達(dá)，可減少p85α對(duì)p110的抑制作用，甚至干擾p85α對(duì)其他基因的調(diào)控，導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路的意外活化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔15～17〕。本研究結(jié)果表明抑制miR-17-5p表達(dá)可能通過上調(diào)PIK3R1，增強(qiáng)p85α對(duì)p110的抑制作用，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路下游蛋白p-AKT和p-PI3K的表達(dá)，從而抑制A431細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，IGF-1可逆轉(zhuǎn)抑制miR-17-5p表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。王延?xùn)|〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-455-3p.1也可通過靶向下調(diào)PIK3R1基因表達(dá)，促進(jìn)p-AKT蛋白表達(dá)，促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。提示miR-17-5p可能通過下調(diào)PIK3R1基因，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)p-AKT和p-PI3K蛋白的表達(dá)，參與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。