紀(jì)大乙，丁 健，田 雨，馬海樂(lè)，2，3，山云輝，陳秀敏，2，3，*

(1.江蘇大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000;2.江蘇大學(xué)食品物理加工研究院，江蘇鎮(zhèn)江212000;3.江蘇大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)際研究中心，江蘇鎮(zhèn)江212000;4.云南省德宏黑柔咖啡有限公司，云南芒市678400)

咖啡是繼水和茶之后的第三大飲料，國(guó)際咖啡組織數(shù)據(jù)顯示，2019年全球咖啡出口總量達(dá)1.687億袋［1］?？Х确N植主要分布于赤道附近的熱帶和亞熱帶地區(qū)如南亞、中南美洲和非洲等。在我國(guó)，咖啡主要種植于云南省。由于咖啡的經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及咖啡與人類(lèi)健康的關(guān)系，咖啡豆的生物活性和化學(xué)成分被廣泛研究?？Х热~通常被認(rèn)為是無(wú)價(jià)值或低價(jià)值的咖啡樹(shù)副產(chǎn)物，有關(guān)咖啡葉的研究還非常欠缺。在主要的咖啡產(chǎn)地如埃塞俄比亞，印度尼西亞等地，咖啡葉具有200多年被作為茶飲料的歷史，而且被當(dāng)?shù)氐木用褡鳛槊褡逅幬镉糜谥委熁蚓徑舛喾N疾病或不適癥狀，比如，在非洲，咖啡葉被用于治療腸道疼痛和腹瀉;在古巴，被用于緩解偏頭痛;在墨西哥，被用于緩解發(fā)燒［2］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)咖啡葉的研究主要側(cè)重于生產(chǎn)地區(qū)、種屬、生長(zhǎng)階段對(duì)其化學(xué)成分的影響方面以及簡(jiǎn)單的應(yīng)用性研究。劉麗［3］采用曬青綠茶的加工工藝對(duì)咖啡鮮葉進(jìn)行加工，研制出咖啡葉茶;山云輝［4］采用熏蒸、揉捻、干燥和包裝的工藝流程將咖啡葉制作成茶。以上研究均通過(guò)對(duì)加工咖啡葉茶的感官評(píng)價(jià)來(lái)研究加工工藝并制備出色香味上乘的咖啡葉茶，然而這些研究并未探討茶葉加工過(guò)程如何影響咖啡葉茶的化學(xué)成分以及生物活性。

由于咖啡葉含有豐富的植物化學(xué)成分，包括生物堿(咖啡因和葫蘆巴堿)、酚酸類(lèi)(咖啡酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥酸)、黃酮類(lèi)化合物(花青素、槲皮素、槲皮素葡萄糖苷、異櫟素、蕓香苷、山萘酚)、兒茶酚類(lèi)化合物、氧雜蒽酮類(lèi)化合物(芒果素、異芒果素)以及氨基酸等活性化合物［5］，近年來(lái)，咖啡葉對(duì)人體健康的影響受到了越來(lái)越多的關(guān)注?？Х热~中的化學(xué)成分具有抗氧化、抗炎癥、抗癌癥等生物活性［6］。本實(shí)驗(yàn)室曾采用多種茶葉加工方法，將咖啡葉加工成茶，并研究了各種茶葉加工方法對(duì)咖啡葉的化學(xué)成分、抗氧化和抗炎活性的影響［7－9］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，日式綠茶加工法加工的咖啡葉茶具有最高的化學(xué)成分和生物活性，而紅茶加工法加工的咖啡葉茶則含有最低的活性成分。然而，每一個(gè)加工步驟(萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥)如何影響咖啡葉的基礎(chǔ)成分、化學(xué)成分和抗氧化活性，以及上述指標(biāo)在每一加工步驟中的變化規(guī)律如何尚未知。因此，本研究對(duì)不同葉齡的咖啡葉進(jìn)行分步處理，探索葉齡和每個(gè)加工步驟對(duì)咖啡葉中基礎(chǔ)成分、化學(xué)成分和抗氧化活性的影響規(guī)律，以期闡明影響咖啡葉茶質(zhì)量的關(guān)鍵步驟，為高品質(zhì)的咖啡葉茶的優(yōu)化加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿拉比卡卡地莫咖啡樹(shù)鮮葉 于2018年8月29號(hào)上午采摘自云南后谷咖啡種植園，咖啡葉初步篩選后裝紙箱并放入冰袋，然后經(jīng)空運(yùn)于8月31日到達(dá)鎮(zhèn)江，進(jìn)行進(jìn)一步的加工;綠原酸異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品(5－咖啡?？崴?5－caffeoylquinic acid，5－CQA)、4－咖啡?？崴?4－caffeoylquinic acid，4－CQA)、3－咖啡酰奎尼酸(3－caffeoylquinic acid，3－CQA)、3，5－二咖啡?？崴?3，5－dicaffeoylquinic acid，3，5－diCQA)、3，4－二 咖 啡 酰 奎 尼 酸(3，4－dicaffeoylquinic acid，3，4－diCQA)、4，5－二咖啡?？崴?4，5－dicaffeoylquinic acid，4，5－diCQA))、蘆丁、芒果苷、咖啡因、葫蘆巴堿 成都曼思特生物技術(shù)有限公司;2，2＇－聯(lián)氮－雙－3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸(2，2＇－azino－bis(3－ethylbenzoth－iazoline－6－sulfonic acid，ABTS)、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－trinitro－phenylhydrazine，DPPH)、6－羥基－2，5，7，8－四甲基色烷－2－羧酸(6－h(huán)ydroxy－2，5，7，8－tetramethylchroman－2－carboxylic acid，TROLOX) 上海MACKLIN公司;福林酚試劑(Folinol reagent，F(xiàn)C)北京SOLARBIO公司;乙腈(Acetonitrile，ACN)、2，4，6－三吡啶基三嗪(2，4，6－Tri(2－pyridyl)－striazine，TPTZ)、2，2－偶氮二(2－甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2，2＇－Azobismethylpropionamidine)dihydrochlorid，AAPH)及其它化學(xué)試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

SPD－M20A高效液相色譜系統(tǒng)(SPD－M20A high performance liquid chromatography system，HPLC)日本島津公司;Tecan Spark?10M酶標(biāo)儀 上海帝肯貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 咖啡葉加工 將新鮮的咖啡葉分為幼葉(Y)和成熟葉(M)，根據(jù)Chen等［8］處理咖啡葉方法對(duì)鮮咖啡葉進(jìn)行加工處理。將鮮咖啡幼葉和成熟葉分別進(jìn)行萎凋12 h，揉捻5 min，發(fā)酵2 h或48 h后曬干。咖啡幼葉發(fā)酵2 h表示為Y－2 h，咖啡幼葉發(fā)酵48 h表示為Y－48 h，咖啡成熟葉發(fā)酵2 h表示為M－2 h，咖啡成熟葉發(fā)酵48 h表示為M－48 h。咖啡葉每經(jīng)過(guò)一個(gè)加工步驟后分成兩部分，一部分用于冷凍干燥，另一部分繼續(xù)后續(xù)的加工，直到干燥。將干燥后的咖啡葉磨成粉末過(guò)100目篩子，然后保存于－20℃冰箱中備用。

1.2.2 咖啡葉預(yù)處理 稱(chēng)取0.5 g干咖啡葉粉末于100 mL燒杯中，加入15 mL沸水，于100℃水浴鍋中提取10 min，然后用中速定性濾紙抽真空過(guò)濾，固體殘?jiān)儆孟嗤w積的沸水提取一次，兩次提取上清液混合并分裝保存于－80℃冰箱中備用。

1.2.3 基礎(chǔ)成分測(cè)定 參照GB 5009.3－2016測(cè)定水分;GB/T 8305－2013測(cè)定水浸出物;苯酚比色法測(cè)定可溶性糖［10］;茚三酮法測(cè)定游離氨基酸(GB/T 8314－2002);凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)(GB 5009.5－2010)。

1.2.4 植物化學(xué)成分測(cè)定

1.2.4.1 HPLC定量分析生物堿和多酚 根據(jù)Chen等［8］測(cè)定植物化學(xué)成分的方法。采用HPLC法對(duì)咖啡葉提取物中的葫蘆巴堿、咖啡因、芒果苷、蘆丁、綠原酸(3－CQA，4－CQA，5－CQA，3，4－diCQA，3，5－diCQA，4，5－diCQA)含量進(jìn)行測(cè)定。將咖啡葉提取物用超純水稀釋兩倍，過(guò)濾器(0.22μm)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

色譜條件:色譜柱:Phenomenex Kinetex C18(100 mm×4.8 mm，5μm);時(shí)間程序:0～10 min，95%～80%A;10～13.5 min，80%A;13.5～18 min，80%～95%A;18～21 min，95%～5%A;21～23 min，5%～95%A;23～25 min，95%A，A相為0.1%三氟乙酸，B相為ACN;柱溫:25℃;流速:1.5 mL/min;進(jìn)樣量:5μL。用Waters 2998 PDA檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為葫蘆巴堿(264 nm)、咖啡因(280 nm)、芒果苷和蘆丁(257 nm)、綠原酸(325 nm)。

1.2.4.2 總酚含量測(cè)定 總酚含量(Total phenol content，TPC)測(cè)定根據(jù)Chen等［9］描述的方法進(jìn)行了一些修改。將樣品稀釋20倍，在96孔板上先加入0.1 mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品/樣品20μL，再加入100μL 10倍稀釋的FC試劑，室溫反應(yīng)1 min，最后加入80μL 75 mg/mL碳酸鈉(NaCO3)溶液，室溫避光反應(yīng)30 min后在765 nm處測(cè)量吸光度。

1.2.4.3 總黃酮含量測(cè)定 根據(jù)趙佳利等［11］所描述的方法測(cè)定總黃酮含量(Total flavonoids content，TFC)。將樣品用70%乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在20 mL試管中先加入4 mL 0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，靜置6 min后加入4 mL的4%氫氧化鈉溶液，最后加入1.7 mL的30%乙醇溶液，靜置15 min后在510 nm處測(cè)量吸光度。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 ABTS分析 根據(jù)Chen等［12］的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定分析。將樣品用水稀釋20倍，在96孔板上先加入0.25 mmol Trolox標(biāo)準(zhǔn)品/樣品(0～20μL)，再加入180μL ABTS工作溶液，室溫避光反應(yīng)10 min，在734 nm處測(cè)量吸光度。然后用公式(1)計(jì)算出不同濃度下的抑制率，以濃度為橫坐標(biāo)抑制率為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，分別得到樣品和Trolox的回歸曲線?？寡趸钚砸訲rolox當(dāng)量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)表示，通過(guò)公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

式中:Abscontrol表示ABTS工作液的吸光度即陽(yáng)性對(duì)照，Abssample表示樣品+ABTS工作液的吸光度，Absblank表示只有水的吸光度即陰性對(duì)照。

式中:樣品或Trolox斜率是以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)所作曲線的斜率。

1.2.5.2 DPPH分析 根據(jù)Chen等［12］提出的方法進(jìn)行DPPH測(cè)定。將樣品用甲醇稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，在96孔板上先加入0.2 mmol Trolox標(biāo)準(zhǔn)品/樣品(0～180μL)，再加入20μL DPPH工作溶液，室溫避光反應(yīng)10 min，在519 nm處測(cè)量吸光度。結(jié)果以TEAC表示，計(jì)算方法同上。

1.2.5.3 FRAP分析 根據(jù)Benzie等［13］的方法進(jìn)行FRAP測(cè)量。將樣品用乙醇稀釋10倍，在96孔板上先加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，再加入180μL FRAP工作溶液，37℃反應(yīng)20 min，在593 nm處測(cè)量吸光度。結(jié)果以TEAC表示，計(jì)算方法同上。

1.2.5.4 ORAC分析 根據(jù)Chen等［12］提出的方法進(jìn)行ORAC測(cè)定。將樣品用水稀釋1000倍，在96孔板上先加入2 mmol Trolox標(biāo)準(zhǔn)品/樣品(0～40μL)，再加入100μL磷酸鹽緩沖液(75 mmol pH 7.0)，60μL熒光素鈉鹽(200 nmol)，37℃反應(yīng)10 min，最后加入200 mmol AAPH，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)527 nm條件下測(cè)量吸光度60次。用公式(3)計(jì)算曲線下面積后與樣品濃度進(jìn)行回歸，然后以樣品的回歸曲線的斜率除以Trolox的斜率將ORAC值換算成Trolox當(dāng)量。

式中:Ai為在第i次的熒光強(qiáng)度，A1為第1次的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 相關(guān)性分析 將上述所測(cè)指標(biāo)(基礎(chǔ)成分、植物化學(xué)成分和抗氧化活性)進(jìn)行相關(guān)性分析，分析各指標(biāo)與加工步驟之間的關(guān)系。用MINITAB 17軟件(Minitab Inc.，State College，PA，USA)進(jìn)行主成分分析結(jié)果的分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖，數(shù)據(jù)表示為三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用MINITAB 17軟件(Minitab Inc.，State College，PA，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Tukey檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)分析各組之間的顯著差異，P＜0.05表明有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)成分分析

表1為咖啡葉經(jīng)各加工步驟后基礎(chǔ)成分包括水分、水浸出物、可溶性糖、游離氨基酸、可溶性蛋白的含量?？Х热~中水分含量受每個(gè)加工步驟的影響顯著(P＜0.05)，呈下降趨勢(shì)，且幼葉的含水量始終高于成熟葉。由于咖啡葉含水量隨著葉齡的增長(zhǎng)而降低，所以鮮咖啡幼葉含水量(79.87%)顯著高于成熟葉(72.65%)，且在萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥過(guò)程中幼葉與成熟葉含水量之間存在顯著性差異。比較發(fā)酵時(shí)間對(duì)咖啡葉水分含量的影響發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵2 h的咖啡葉含水量高于48 h，可能是因?yàn)樗衷诎l(fā)酵過(guò)程中逐漸蒸發(fā)［14］。

表1 咖啡葉中基礎(chǔ)成分含量(%)Table 1 Proximate composition content of coffee leaves(%)

鮮咖啡幼葉和成熟葉的水浸出物含量分別為35.26%和34.18%無(wú)顯著性差異?？Х扔兹~和成熟葉的水浸出物含量在加工過(guò)程中總體上呈下降趨勢(shì)，可能是由于在加工過(guò)程中不可揮發(fā)的化合物轉(zhuǎn)化成可揮發(fā)的香氣物質(zhì)［15］;發(fā)生氧化聚合反應(yīng)與化學(xué)聚合反應(yīng)等，使得可溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)化成不可溶性物質(zhì)［16］，從而使得水浸出物含量降低;在發(fā)酵過(guò)程中可溶性化合物被微生物代謝消耗等［17］?？Х热~水浸出物含量受每個(gè)加工步驟影響但影響效果不同，發(fā)酵和干燥使幼葉水浸出物含量顯著下降(P＜0.05)，但萎凋和揉捻不顯著;發(fā)酵48 h的成熟葉中水浸出物含量顯著降低(P＜0.05)。萎凋時(shí)咖啡幼葉和成熟葉的水浸出物含量降低，其原因是鮮葉維持生命活動(dòng)的消耗［18］;發(fā)酵和干燥過(guò)程中，咖啡幼葉的水浸出物含量顯著降低(P＜0.05)，是因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)消耗了部分水浸出物且酚類(lèi)化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)結(jié)合生成不可溶化合物［16］?？Х热~的年齡顯著影響每個(gè)加工步驟中的水浸出物的含量，且幼葉水浸出物含量高于成熟葉(發(fā)酵48 h除外)。發(fā)酵時(shí)間顯著影響咖啡葉的水浸出物的含量，且對(duì)不同葉齡的咖啡葉的影響程度不同。發(fā)酵2 h的水浸出物含量高于48 h，因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)消耗水浸出物［16］。幼葉發(fā)酵48 h后水浸出物相對(duì)于前一步驟降低了8.35%，而成熟葉水浸出物只降低了3.27%，其原因可能與幼葉中的酶活性高，微生物生長(zhǎng)和消耗快有關(guān)［19］。

可溶性糖是增加咖啡葉茶茶湯甜味和減少苦澀味的關(guān)鍵，且可溶性糖可以與游離氨基酸產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，是咖啡葉茶香氣與風(fēng)味物質(zhì)的重要來(lái)源。因此，了解各加工步驟中可溶性糖含量的變化規(guī)律以及影響可溶性糖含量的關(guān)鍵步驟，對(duì)制備出高品質(zhì)咖啡葉茶至關(guān)重要。由表1所示，鮮咖啡幼葉與成熟葉的可溶性糖含量分別為5.88%和5.25%，有顯著性差異(P＜0.05)，可能是隨著咖啡葉葉片的成熟，其光合作用不斷增強(qiáng)但呼吸速率下降，所以成熟葉中的碳水化合物主要為淀粉［19］，因此可溶性糖含量少。在加工過(guò)程中，可溶性糖含量因葉齡和加工方法的不同而存在差異。萎凋時(shí)咖啡幼葉可溶性糖含量顯著降低，成熟葉含量升高，其原因可能為萎凋時(shí)淀粉酶活性提高促進(jìn)淀粉水解［16］，使得成熟葉可溶性糖含量升高，而幼葉在多糖水解的同時(shí)發(fā)生呼吸氧化且呼吸氧化占主導(dǎo)作用［20］，因此幼葉中可溶性糖含量降低;揉捻，發(fā)酵48 h和干燥過(guò)程中咖啡葉可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)，但2 h發(fā)酵后干燥的葉子可溶性糖含量升高。發(fā)酵2 h后可溶性糖含量顯著高于48 h，其原因可能在微生物和酶等作用下，可溶性糖被消耗［21］。

氨基酸是咖啡葉茶香氣和滋味的主要來(lái)源，是茶良好滋味的主要物質(zhì)，因此盡量減少因加工造成的游離氨基酸含量的降低是保持咖啡葉茶茶湯鮮味的保障。由表1所示，鮮咖啡幼葉和成熟葉之間氨基酸含量相似，無(wú)顯著性差異，含量分別為2.03%、2.06%;氨基酸含量在加工過(guò)程中的變化趨勢(shì)與咖啡葉的年齡相關(guān)。在咖啡幼葉中，萎凋過(guò)程使氨基酸含量顯著(P＜0.05)增高，相對(duì)鮮咖啡幼葉增高0.43%，是原因萎凋時(shí)水分減少，蛋白酶酶活升高，使得蛋白質(zhì)和多肽被水解成氨基酸，而成熟葉萎凋時(shí)氨基酸無(wú)顯著性差異，是因?yàn)槌墒烊~中蛋白酶的活性較幼葉低，因此在萎凋過(guò)程中水解生成的氨基酸相對(duì)較少，從而氨基酸的含量變化不大［22－23］。揉捻時(shí)咖啡葉氨基酸含量升高或保持不變，但在發(fā)酵和干燥過(guò)程中氨基酸含量下降，其原因是受溫度、微生物和酶的影響，氨基酸產(chǎn)生多種反應(yīng)包括氨基酸熱降解、酶促降解、美拉德反應(yīng)等，導(dǎo)致氨基酸含量降低［24］;且加工的步驟對(duì)幼葉的影響比成熟葉大，可能是因?yàn)橛兹~中的酶活性更高，因此受影響更大［25］。發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基酸含量的影響程度與葉齡相關(guān)。幼葉中的氨基酸含量在發(fā)酵48 h后下降了1.08%，而成熟葉只下降了0.30%，其原因幼葉具有更高的酶活，因此發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，微生物分解代謝氨基酸量越多［25］。

由表1所示，鮮咖啡幼葉與成熟葉之間可溶性蛋白含量相似，無(wú)顯著性差異，含量分別為1.99%，1.76%?？Х热~中可溶性蛋白含量受每個(gè)加工步驟的影響不顯著，與鮮咖啡葉比較，上下幅度在0.02%～0.38%之間。萎凋時(shí)咖啡葉可溶性蛋白含量略降低，原因?yàn)槲蚴沟每Х热~水分減少，細(xì)胞液濃度增高，酶活增加，可溶性蛋白被酶解［26］;揉捻時(shí)含量略升高，可能因?yàn)槿嗄硎辜?xì)胞破碎，促進(jìn)可溶性蛋白的溶解［27］;干燥過(guò)程使得咖啡葉可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，幼葉與成熟葉的含量分別為2.37%、1.98%，比鮮葉高0.38%、0.22%。由于咖啡葉年齡的不同，在萎凋和發(fā)酵過(guò)程中，幼葉與成熟葉的蛋白含量存在顯著性(P＜0.05)差異。發(fā)酵時(shí)間對(duì)咖啡葉可溶性蛋白含量無(wú)顯著影響。在整個(gè)加工過(guò)程中，咖啡葉中可溶性蛋白含量變化不顯著。

2.2 植物化學(xué)成分分析

2.2.1 HPLC定量分析生物堿和多酚 圖1(A)為植物化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，圖1(B)為鮮咖啡幼葉的高效液相色譜圖，咖啡葉中的植物化學(xué)成分的含量在表2中顯示。表2為咖啡葉經(jīng)各加工步驟后植物化學(xué)成分包括咖啡因、芒果苷、蘆丁、3－CQA、4－CQA、5－CQA、3，4－diCQA、3，5－diCQA的含量。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)、鮮咖啡幼葉樣品(B)在257 nm的高效液相光譜圖Fig.1 HPLC profile at 257 nm of Standard(A)and Fresh young coffee leaf sample(B)

咖啡因又稱(chēng)1，3，7－三甲基黃嘌呤，是一種興奮劑，具有消除疲勞、促進(jìn)新陳代謝和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用［28］。有研究表明咖啡因可以預(yù)防早產(chǎn)兒支氣管肺炎［29］和阿爾茨海默癥［30］等疾病。由表2所示，鮮咖啡幼葉中咖啡因的含量(24.65 mg/g)顯著(P＜0.05)高于成熟葉(10.85 mg/g)，其原因?yàn)橛兹~中的咖啡因合成酶活性高，因此合成的咖啡因含量高［31］。隨著葉片的成熟，咖啡漿果生成，葉子中的咖啡因轉(zhuǎn)移到果實(shí)中，且咖啡因會(huì)緩慢代謝生成黃嘌呤，從而導(dǎo)致成熟葉中咖啡因的含量降低［31］。咖啡葉中咖啡因含量受每個(gè)加工步驟的影響程度不同，幼葉在整個(gè)加工過(guò)程中總體上呈下降趨勢(shì)，由鮮葉的24.65 mg/g降為發(fā)酵2 h(48 h)后的17.13 mg/g(18.33 mg/g)，而干燥后其含量又有所上升，其原因?yàn)槲?、揉捻和發(fā)酵過(guò)程使得咖啡葉水分減少，細(xì)胞破碎和微生物繁殖，導(dǎo)致咖啡因合成酶活性低而N－脫甲基酶活性高，減少咖啡因的合成而加快代謝［32］;成熟葉中咖啡因含量變化不顯著可能是因?yàn)榭Х纫蛑饕谟兹~中合成［31］。萎凋，揉捻，發(fā)酵和干燥加工步驟均因咖啡葉年齡的不同存在顯著性差異，且在整個(gè)加工流程中咖啡幼葉的咖啡因含量均高于成熟葉，可能是因?yàn)轷r咖啡幼葉的咖啡因含量高于成熟葉且幼葉中咖啡因合成酶活性高［31］。

由表2所示，鮮咖啡幼葉和成熟葉芒果苷含量差異顯著(P＜0.05)，含量分別為3.63和0.83 mg/g;蘆丁含量差異顯著(P＜0.05)，含量分別為2.09和0.74 mg/g?？Х热~中芒果苷和蘆丁含量受每個(gè)加工步驟影響顯著。萎凋時(shí)咖啡幼葉與成熟葉中芒果苷和蘆丁含量顯著升高;揉捻時(shí)含量顯著降低，原因?yàn)槿嗄砥茐募?xì)胞，酶與底物接觸徹底，發(fā)生多酚類(lèi)化合物的酶促氧化反應(yīng)［33］;發(fā)酵時(shí)含量顯著降低(M－2 h除外)，是由于在酶和微生物作用下芒果苷和蘆丁被降解［34］，而M－2 h時(shí)芒果苷和蘆丁含量顯著升高(P＜0.05);干燥時(shí)含量升高(M－2 h除外)，可能是因?yàn)樵跓嶙饔孟?，結(jié)合多酚轉(zhuǎn)化成游離多酚［31］。由于咖啡幼葉和成熟葉的初始含量顯著不同，所以在萎凋，揉捻，發(fā)酵和干燥加工步驟中也存在顯著性差異。發(fā)酵2 h的芒果苷和蘆丁含量高于48 h，其原因可能隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚類(lèi)化合物在多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)或過(guò)氧化氫酶(Peroxidase，POD)的作用下發(fā)生酶促褐變反應(yīng)，使得芒果苷和蘆丁等物質(zhì)氧化生成醌類(lèi)化合物，從而含量降低［35］。

表2 咖啡葉植物化學(xué)成分含量(mg/g)Table 2 Phytochemical content in coffee leaves(mg/g)

綠原酸(3－CQA，4－CQA，5－CQA，3，4－diCQA，3，5－diCQA)是咖啡葉中重要的酚類(lèi)化合物但含量相對(duì)較少，其中5－CQA含量最高。由表2所示，咖啡葉中綠原酸含量受每個(gè)加工步驟的影響總體呈先下降后升高的趨勢(shì)。萎凋時(shí)綠原酸含量降低，原因可能為萎凋使咖啡葉水分降低，酶活升高，綠原酸在PPO或POD酶作用下發(fā)生酶促褐變反應(yīng)氧化生成醌類(lèi)化合物［35］;揉捻時(shí)含量降低是因?yàn)槿嗄磉^(guò)程中細(xì)胞破碎，綠原酸與酶充分接觸發(fā)生酶促褐變反應(yīng);發(fā)酵時(shí)含量總體呈下降趨勢(shì)，原因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中綠原酸發(fā)生酚酶氧化和非酶氧化反應(yīng)［36］;干燥時(shí)含量顯著(P＜0.05)升高是因?yàn)樵跓嶙饔孟戮G原酸由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)［37］。鮮咖啡幼葉的綠原酸含量高于成熟葉是因?yàn)楹铣傻木G原酸會(huì)隨著咖啡樹(shù)的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，且隨著咖啡漿果的生長(zhǎng)，綠原酸從咖啡葉中轉(zhuǎn)移到漿果中，從而使成熟葉中的綠原酸含量降低。發(fā)酵2 h的綠原酸含量高于48 h，其原因可能隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在酶和微生物作用下綠原酸氧化分解越多，但發(fā)酵2 h后干燥樣品的綠原酸含量低于48 h，其原因可能為水分的不同導(dǎo)致的。

2.2.2 總酚及總黃酮含量分析 酚類(lèi)化合物是常見(jiàn)的抗氧化劑［38－39］。如表3所示，鮮咖啡幼葉的TPC含量顯著(P＜0.05)高于成熟葉，含量分別為40.53，20.69 mg/g，其原因可能隨著葉片的成熟，酚類(lèi)化合物中的綠原酸轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素且轉(zhuǎn)移到漿果中［31］?？Х热~中TPC含量受每個(gè)加工步驟的影響呈波浪式變化。萎凋時(shí)咖啡幼葉與成熟葉中TPC含量顯著降低，分別為26.75，14.37 mg/g，原因?yàn)槲蜻^(guò)程中咖啡葉水分減少，氧化反應(yīng)和酶促反應(yīng)活躍，多酚類(lèi)化合物在PPO的作用下生成鄰醌［40］;揉捻時(shí)TPC含量顯著升高(P＜0.05);發(fā)酵時(shí)TPC含量總體呈下降趨勢(shì)，原因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中TPC發(fā)生酚酶氧化轉(zhuǎn)化為醌類(lèi)物質(zhì)［36］，但成熟葉發(fā)酵2 h呈上升趨勢(shì)，其原因可能為福林酚法測(cè)定總酚含量時(shí)受可溶性糖等物質(zhì)的干擾使得結(jié)果偏高［41］;干燥時(shí)TPC含量顯著增高，原因可能為干燥使得水分急劇下降且在熱作用下使得咖啡葉中的結(jié)合多酚轉(zhuǎn)化為游離多酚［31］。有研究人員證實(shí)，幼葉比成熟葉具有更多的酚類(lèi)化合物［42－43］?？Х热~的年齡顯著影響每個(gè)加工步驟中幼葉與成熟葉的TPC含量，除了咖啡幼葉經(jīng)2 h發(fā)酵后干燥的葉子TPC含量低于其相對(duì)應(yīng)的成熟葉外，其它步驟中幼葉的TPC含量都顯著高于成熟葉。發(fā)酵時(shí)間顯著影響咖啡葉TPC含量，且對(duì)不同年齡的咖啡葉的影響程度不同?？Х热~發(fā)酵2 h的TPC含量顯著高于48 h，是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，多酚類(lèi)化合物在PPO酶作用下被氧化［31］。

表3 咖啡葉中總酚和總黃酮含量(mg/g)Table 3 Content of TPCand TFC in coffee leaves(mg/g)

黃酮類(lèi)化合物也具有一定的抗氧化能力［44］，由表3所示，鮮咖啡幼葉總黃酮含量顯著(P＜0.05)高于成熟葉，含量分別為12.81和7.51 mg/g，其原因?yàn)閱翁擒蘸投擒找约叭擒赵谟兹~中積累，隨著葉片的成熟，黃酮醇含量逐漸減少［45］，咖啡葉中總黃酮含量受每個(gè)加工步驟影響呈波浪式變化但幼葉與成熟葉的變化趨勢(shì)相反，幼葉呈下降升高下降趨勢(shì)，成熟葉呈升高下降升高趨勢(shì)。萎凋時(shí)幼葉總黃酮含量降低4.69 mg/g，成熟葉升高0.39 mg/g，其原因可能為萎凋時(shí)水分減少使得酶活增加，黃酮醇類(lèi)化合物在酶作用下降解;揉捻時(shí)幼葉總黃酮含量從鮮葉的12.81 mg/g下降為8.82 mg/g，成熟葉從7.51 mg/g下降為5.98 mg/g，其原因可能為揉捻時(shí)酶與底物充分接觸促使黃酮類(lèi)物質(zhì)快速降解［31］;發(fā)酵時(shí)幼葉總黃酮含量顯著降低，其原因?yàn)樵诿缸饔孟?，黃酮類(lèi)化合物被降解［33］，而成熟葉含量顯著升高可能是因?yàn)樯傻泥忰任镔|(zhì)抑制了PPO活性?？Х热~的年齡顯著影響揉捻步驟和發(fā)酵48 h后的干燥步驟?？Х热~發(fā)酵2 h的總黃酮含量高于48 h，是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，黃酮類(lèi)化合物在相關(guān)酶作用下被降解［36］。

2.3 抗氧化活性分析

大量的研究表明植物中的多酚類(lèi)化合物是很好的抗氧化劑［44－46］。植物中的抗氧化物清除自由基的機(jī)制主要包括以下兩方面:氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)和電子轉(zhuǎn)移(ET)［47］，其中ORAC分析法屬于前者，而FRAP、DPPH、ABTS分析法則基于電子轉(zhuǎn)移。本文通過(guò)ABTS、DPPH、FRAP和ORAC四種方法研究加工咖啡葉抗氧化性能變化。

如表4所示，用四種抗氧化方法測(cè)定不同加工步驟咖啡幼葉和成熟葉，因每種方法的原理不同，所得的抗氧化能力存在差異。因?yàn)轷r咖啡幼葉中的酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物含量高于成熟葉，所以鮮咖啡幼葉的抗氧化能力顯著高于成熟葉?？Х热~的抗氧化能力在每個(gè)加工步驟中因多酚類(lèi)化合物含量的變化而變化。在萎凋和揉捻的加工步驟中，幼葉的四種抗氧化能力均高于成熟葉，但發(fā)酵和干燥過(guò)程因方法原理不同呈現(xiàn)出不同的抗氧化能力。萎凋時(shí)因酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物的減少，四種方法測(cè)定的抗氧化能力均降低，且幼葉高于成熟葉;揉捻時(shí)咖啡葉抗氧化能力幾乎呈上升趨勢(shì)但DPPH和FRAP方法中成熟葉的抗氧化能力降低，可能是因?yàn)榭Х热~的抗氧化性除了受酚類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物影響還受其他抗氧化物質(zhì)的影響，如蛋白和維生素等［48］;發(fā)酵時(shí)四種方法測(cè)定的抗氧化能力變化趨勢(shì)與酚類(lèi)和黃酮類(lèi)變化趨勢(shì)一致;干燥時(shí)抗氧化能力升高，其原因?yàn)榭偡雍涂傸S酮等抗氧化物質(zhì)含量升高［49］。咖啡葉的年齡影響每個(gè)加工步驟中幼葉與成熟葉的抗氧化能力但影響程度不同?？Х扔兹~和成熟葉發(fā)酵2 h的抗氧化能力顯著高于48 h，與多酚化合物的變化趨勢(shì)一致。

2.4 基礎(chǔ)成分、植物化學(xué)成分和抗氧化活性相關(guān)性分析

對(duì)含有多個(gè)變量的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，可以將高維度的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，找到數(shù)據(jù)中方差最大的主分量，以便找出原始數(shù)據(jù)中的特征和規(guī)律。圖2(A)為根據(jù)加工步驟和咖啡葉齡對(duì)咖啡葉的分值圖，Y表示咖啡幼葉，M表示咖啡成熟葉;圖2(B)為咖啡葉18個(gè)變量的載荷圖(水浸出物、可溶性糖、游離氨基酸、可溶性蛋白、咖啡因、芒果苷、蘆丁、3－CQA、4－CQA、5－CQA、3，4－diCQA、3，5－diCQA、TPC、TFC、ABTS、ORAC、DPPH、FRAP)。分值圖可解析第一和第二主分量中的聚類(lèi)、趨勢(shì)以及異常值，荷載圖則更直觀的解釋前兩個(gè)主分量主要是與哪些變量相關(guān)。荷載圖中的變量越靠近則越相關(guān)，如果在相反的兩個(gè)反向則負(fù)相關(guān)，而如果互相垂直則不相關(guān)。結(jié)果表明，前三個(gè)主分量分別占總方差的52.1%、22.8%和10.5%，因此前三個(gè)主分量解釋85.4%數(shù)據(jù)變異。通常對(duì)于描述目的，只需要解釋80%的方差，因此前三個(gè)主分量足夠解釋數(shù)據(jù)的變異量。分值圖顯示，咖啡葉的相似性可以根據(jù)加工步驟和葉齡分成4組(圖2(A))，其中幼葉和老葉發(fā)酵48 h為一組(發(fā)酵－M－48 h和發(fā)酵－Y－48 h);除了幼葉發(fā)酵2 h后干燥的樣品其它的干燥咖啡葉為一組(干燥－M－2 h，干燥－M－48 h，干燥－Y－48 h);未經(jīng)發(fā)酵的幼葉為一組(鮮葉－Y，萎凋－Y，揉捻－Y);其它咖啡葉為一組。從載荷圖和特征系數(shù)可以看出第一主分量與咖啡葉的植物化學(xué)成分含量和抗氧化性相關(guān)，而第二主分量則與基礎(chǔ)成分如水浸出物、可溶性糖和游離氨基酸正相關(guān)，然而與可溶性蛋白含量卻存在弱負(fù)相關(guān)。未經(jīng)過(guò)發(fā)酵和干燥的幼咖啡葉含有較高的游離氨基酸、可溶性糖、游離氨基酸、蘆丁、芒果苷、TFC等，而干燥后的樣品綠原酸的含量相對(duì)較高。發(fā)酵48 h的咖啡葉則植物化學(xué)成分、抗氧化性和基礎(chǔ)成分都相對(duì)較低。從主成分分析圖可以看出發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短以及干燥的過(guò)程對(duì)咖啡葉的植物化學(xué)成分和抗氧化性有較大的影響。

表4 咖啡葉的抗氧化活性(μmol Trolox/g leaf)Table 4 Antioxidant capacities of coffee leaves(μmol Trolox/g leaf)

圖2 主成分分析Fig.2 Principal component analysis

3 結(jié)論

本研究表明鮮咖啡幼葉的水分含量、可溶性糖、可溶性蛋白、咖啡因、多酚類(lèi)化合物、總酚、總黃酮、抗氧化活性顯著(P＜0.05)高于成熟咖啡葉，然而水浸出物和游離氨基酸受葉齡的影響并不顯著?？Х热~的基礎(chǔ)成分、植物化學(xué)成分、抗氧化性在加工過(guò)程中的變化受咖啡葉年齡和加工步驟的協(xié)同影響。水分含量在加工過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，水浸出物、可溶性糖、游離氨基酸和可溶性蛋白含量呈波浪式變化;每個(gè)加工步驟對(duì)幼葉和成熟葉的影響效果不同;發(fā)酵2 h的基礎(chǔ)成分含量高于48 h?？Х热~中的植物化學(xué)成分和抗氧化活性在前三個(gè)加工步驟中基本上呈下降趨勢(shì)，然而在干燥后則有所升高?？Х纫蚝吭谟兹~中呈下降趨勢(shì)，成熟葉中變化不顯著，芒果苷和蘆丁含量呈先升高后降低再升高趨勢(shì)，綠原酸含量呈先降低后升高趨勢(shì)，總酚和總黃酮含量總體呈先降低后升高趨勢(shì);與基礎(chǔ)成分相同，咖啡葉經(jīng)2 h發(fā)酵的植物化學(xué)成分、總酚、總黃酮以及抗氧化活性顯著高于發(fā)酵48 h的咖啡葉。

發(fā)酵步驟是影響咖啡葉的水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖、植物化學(xué)成分、抗氧化性的關(guān)鍵步驟，發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，上述指標(biāo)下降地越多。然而，發(fā)酵過(guò)程對(duì)可溶性蛋白的影響并不顯著，表明在發(fā)酵的過(guò)程中咖啡葉的酶和微生物主要利用小分子量的化合物。干燥過(guò)程對(duì)咖啡葉的植物化學(xué)成分和抗氧化活性影響較大，相較于發(fā)酵步驟，干燥過(guò)程能顯著地提高植物化學(xué)成分和抗氧化活性?？Х热~的植物化學(xué)成分和抗氧化性與第一主成分相關(guān)，而第二主成分則與基礎(chǔ)成分的關(guān)聯(lián)較大，且發(fā)酵、干燥和葉齡是造成樣品差異的主要原因。因此在未來(lái)的研究中可側(cè)重研究如何優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程以保存更多的多酚類(lèi)化合物以及研究干燥過(guò)程如何影響結(jié)合和游離多酚的含量以及是否會(huì)生成其它具有抗氧化活性的化合物。