李艷寧，李光琪，屈昱良，潘俊斐，楚元奎，張曉春，徐廣賢，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，銀川 750004；3.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，東莞 523000）

納米抗體是存在于駱駝科體內(nèi)的一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy chain variable area，VHH），具有分子量小、特異性高、易通過(guò)血腦屏障等眾多優(yōu)勢(shì)，有廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前，納米抗體制備所采用的關(guān)鍵技術(shù)是噬菌體表面展示技術(shù)，其原理是通過(guò)對(duì)目標(biāo)抗原反復(fù)的“吸附—洗脫—擴(kuò)增”后，使得噬菌體抗體庫(kù)中能與靶分子特異結(jié)合的抗體得到高度富集[2]，一個(gè)庫(kù)容量大及多樣性好的噬菌體納米抗體庫(kù)是獲得特異性抗體的關(guān)鍵所在，特別是針對(duì)天然抗體庫(kù)而言至關(guān)重要。而影響抗體庫(kù)質(zhì)量的主要因素除了需要特異性好的PCR引物外，高轉(zhuǎn)化效率也是實(shí)現(xiàn)構(gòu)建有效噬菌體抗體庫(kù)的關(guān)鍵[3]。

目前，電轉(zhuǎn)化法是構(gòu)建抗體庫(kù)的最佳途徑，也是分子生物學(xué)中的常用技術(shù)，廣泛應(yīng)用于外源基因的表達(dá)、基因克隆及定位等研究[4]。該技術(shù)的主要原理是在瞬間強(qiáng)大電壓的作用下，溶液中細(xì)胞的細(xì)胞膜具有了一定的通透性，從而使帶電的外源物質(zhì)以類似電泳的方式進(jìn)入細(xì)胞膜[5]。在不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的影響下，感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同，故轉(zhuǎn)化效率也存在差異，

因此，應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況，對(duì)電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而探索最佳轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率。影響電轉(zhuǎn)化效率的因素頗多，除了細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)及外源物質(zhì)的質(zhì)量外[6]，電壓影響細(xì)胞膜的穿透性或外源分子與細(xì)胞膜的融合[7]，T4 DNA連接酶也會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率[8]。此外，電轉(zhuǎn)化結(jié)果受到眾多因素的綜合影響，實(shí)際上各個(gè)因素不是孤立存在的，而是相互聯(lián)系、相互作用的。為此，本研究旨在利用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化儀，對(duì)DNA電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最大轉(zhuǎn)化效率。據(jù)此，建立高質(zhì)量的天然噬菌體抗體基因庫(kù)，便于下一步的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器、試劑與培養(yǎng)基0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯、基因電穿孔儀及MyCycler PCR儀（Bio-Rad公司）；Nanodrop 2000、雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TU-1901（Thermo公司）；恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（力康公司）。限制性內(nèi)切酶Not I、Sif I及T4 DNA連接酶（NEB公司）；DNA回收試劑盒（TIANGEN公司）；2×YT培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基，均按常規(guī)配方配制；其余試劑均為分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌TG1和噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e（4522 bp，Amp抗性）為本實(shí)驗(yàn)室保存，駝源VHH DNA片段為本實(shí)驗(yàn)室自行擴(kuò)增，長(zhǎng)約400 bp。

1.2 方法

1.2.1 目的片段與質(zhì)粒的酶切及連接 采用限制性內(nèi)切酶Not I、Sif I分別對(duì)VHH DNA片段及質(zhì)粒pCANTAB5e進(jìn)行酶切，總體系30μL，條件為37℃反應(yīng)1 h，50℃反應(yīng)1 h，之后分別采用2%及1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，用DNA回收試劑盒回收酶切后目的片段，并在10μL連接體系中，噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e與駝源VHH片段按照摩爾比為3∶1的比例，用1μL的T4 DNA連接酶于4℃進(jìn)行過(guò)夜連接，待測(cè)定濃度后保存于-20℃?zhèn)溆?，即本文中所述的外源DNA。

1.2.2 T4 DNA連接酶的去除 取出部分連接產(chǎn)物，采用乙醇沉淀法去除T4 DNA連接酶，具體步驟如下：取出連接產(chǎn)物，加入1/10體積3 M的NaAc（pH5.2），2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后在-20℃靜置30～60 min。然后4℃，13000×g離心10 min，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀1次，并將產(chǎn)物置于超凈工作臺(tái)中待乙醇充分揮發(fā)后，加入適量ddH2O以溶解沉淀并測(cè)定濃度后，于-20℃保存。

1.2.3 電感受態(tài)細(xì)胞的制備 從-80℃冰箱取出大腸桿菌TG1甘油菌，劃線接種于2×YT固體平板上于37℃培養(yǎng)10 h，挑取單個(gè)菌落接種于3 mL的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按1∶100比例將菌液放大培養(yǎng)于含200 mL的2×YT培養(yǎng)基的錐形瓶中，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)一定時(shí)間，后將菌液收集在50 mL離心管中，于冰上靜置1 h，9000 r·min-1，4℃離心10 min，棄上清用相同體積提前預(yù)冷的去離子水重懸菌體沉淀，離心，重復(fù)一次。然后用提前預(yù)冷的10%的甘油重懸菌體并離心。用1 mL 10%的甘油（預(yù)冷的純水配制）混懸菌體沉淀，并分裝在提前預(yù)冷的1 mL EP管中，每管100μL，立即轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存，此即為T(mén)G1電感受態(tài)細(xì)胞。注意：所有步驟在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化 從-80℃冰箱中取出大腸桿菌處于不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)制備的感受態(tài)細(xì)胞。在冰上融化100μL的TG1感受態(tài)細(xì)胞，然后按照設(shè)定的不同條件，加入一定量的連接產(chǎn)物混勻并靜置5 min，接著轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，并設(shè)定電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，向電擊后的細(xì)胞中立即添加1 mL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)至1mL離心管中，37℃，220 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，然后取少量菌液倍比稀釋后涂布于含氨芐青霉素100μg·mL-1的SOC固體平板上，按照設(shè)定的不同培養(yǎng)溫度過(guò)夜培養(yǎng)，次日計(jì)數(shù)菌落個(gè)數(shù)并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，其中，轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg DNA）=菌落數(shù)/DNA量（ng）×稀釋倍數(shù)×1000，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 目的片段與質(zhì)粒的酶切

分別采用1%、2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切后的VHH片段及噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e進(jìn)行驗(yàn)證并回收目的片段，其中酶切結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 目的片段與質(zhì)粒的酶切鑒定圖

2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)階段對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

分別取OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的TG1菌液制備100μL的感受態(tài)細(xì)胞，將加入1μg連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化儀預(yù)設(shè)條件（電容25μF、電阻200Ω、電壓2.5 kV）下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果見(jiàn)圖2。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（OD600值為0.4左右）時(shí)，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率明顯下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，菌體的繁殖速度快，生命力旺盛，對(duì)電擊的損傷修復(fù)能力強(qiáng)，所以經(jīng)電擊后的細(xì)胞存活率相對(duì)較高。

圖2 細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.3 電壓對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

按照2.2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)TG1菌液的OD600在0.4左右時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞，分別設(shè)置電壓為1.8、2.1、2.3、2.5 kV，將1μg的連接產(chǎn)物與100μL感受態(tài)細(xì)胞混合，在25μF電容、200Ω電阻下使用0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，當(dāng)電壓在2.3 kV時(shí)獲得最大轉(zhuǎn)化效率。見(jiàn)圖3。

圖3 電壓對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.4 連接產(chǎn)物質(zhì)量對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

為了比較不同質(zhì)量的外源基因?qū)Ω惺軕B(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化效率是否存在影響，分別取質(zhì)量為0.3、0.5、0.7和1.0μg的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至100μL感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，隨著連接產(chǎn)物質(zhì)量的增加，電轉(zhuǎn)化效率也逐漸提高，當(dāng)連接產(chǎn)物的質(zhì)量大于0.7μg時(shí)，轉(zhuǎn)化效率并未得到提升。

圖4 連接產(chǎn)物質(zhì)量對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 T4 DNA連接酶對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

依據(jù)本文2.2～2.4的研究結(jié)果，當(dāng)TG1菌液的OD600在0.4左右時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞，將0.7μg經(jīng)T4 DNA連接酶去除前的連接產(chǎn)物及T4連接酶去除后的連接產(chǎn)物分別與100μL感受態(tài)細(xì)胞混合，在2.3 kV電壓、25μF電容、200Ω電阻下使用0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)，經(jīng)乙醇沉淀法除去T4 DNA連接酶后，相比于T4 DNA連接酶去除前（2.2×107CFU/μg），轉(zhuǎn)化效率提升（7.9×107CFU/μg）。

圖5 T4 DNA連接酶去除前后對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.6 電轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)溫度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

經(jīng)電轉(zhuǎn)化并孵育結(jié)束后的菌液取適量均勻涂布于含100μg·mL-1Amp的SOC固體平板上，并隨機(jī)分成兩組，一組置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，另一組于30℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日對(duì)克隆數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)兩組轉(zhuǎn)化效率無(wú)差異。見(jiàn)圖6。

圖6 電轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)溫度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

3 討論

構(gòu)建噬菌體納米抗體庫(kù)是基于特定抗原篩選相應(yīng)抗體的一個(gè)重要方法，相比于免疫庫(kù)，天然納米抗體庫(kù)避免了免疫動(dòng)物的繁瑣過(guò)程，同時(shí)理論上可篩選出針對(duì)任何抗原的抗體。納米抗體庫(kù)的高庫(kù)容量是篩選抗體的基本保障，然而要成功構(gòu)建一個(gè)容量大的抗體庫(kù)，首要任務(wù)是提高轉(zhuǎn)化效率?？捎糜谵D(zhuǎn)化的方法很多，如氯化鈣法、Hanahan法和Inoue法，但這些方法操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率偏低，且結(jié)果重復(fù)性差[9]。電轉(zhuǎn)化技術(shù)是目前為止最為有效的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定[10]。該方法幾乎適用于所有細(xì)胞類型，但不同細(xì)胞系有不同的最佳電轉(zhuǎn)條件，不同實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化效率也有所區(qū)別，因而優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件得到相對(duì)穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)化操作方法十分必要。

選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的感受態(tài)細(xì)胞是提高電轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)TG1菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，即OD600在0.4左右時(shí)，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率，隨著細(xì)菌的老化，轉(zhuǎn)化效率有明顯的下降趨勢(shì)，所以制備電轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格掌握菌液的OD600值，以保證較高的轉(zhuǎn)化效率。正如文獻(xiàn)[11]所述，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌雖然對(duì)電擊敏感，死亡率較高，但存活的細(xì)菌中其轉(zhuǎn)化子數(shù)量較高。當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，雖然細(xì)胞存活率上升，但轉(zhuǎn)化效率逐漸下降，因此電轉(zhuǎn)化的細(xì)菌以培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期較為合適。

電壓是決定電轉(zhuǎn)化效率的最主要原因。高電壓可瞬間擊穿細(xì)胞膜并形成能讓外源物質(zhì)進(jìn)入的小孔，由于強(qiáng)電壓會(huì)對(duì)細(xì)胞造成極大的損傷，在此過(guò)程中一部分細(xì)胞會(huì)因此受損而死亡使得轉(zhuǎn)化率降低，并且死亡菌體會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)菌的生存空間從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[12]。因此，選擇合適的電壓是提高轉(zhuǎn)化效率并達(dá)到預(yù)期效果的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置電壓在1.8~2.5 kV進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電壓為2.3 kV時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最好，而電壓低于或高于2.3 kV時(shí)，轉(zhuǎn)化效率均不同程度降低。

電轉(zhuǎn)化時(shí)外源DNA含量對(duì)電轉(zhuǎn)化效率也具有很大的影響[13]。本實(shí)驗(yàn)中，在100μL感受態(tài)細(xì)胞中分別加入0.3、0.5、0.7和1.0μg等不同含量的外源基因進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，當(dāng)其含量在0.7μg時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高。此外，在一定范圍內(nèi)，電轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的用量呈現(xiàn)正向發(fā)展趨勢(shì)，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多時(shí)，轉(zhuǎn)化效率將會(huì)下降，說(shuō)明感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和狀態(tài)。

T4 DNA連接酶在一定程度上也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。研究表明，T4 DNA連接酶以共價(jià)作用與DNA結(jié)合，同時(shí)具有拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，可打開(kāi)超螺旋DNA的一條鏈，使其變成單切口環(huán)狀，然后進(jìn)行連接修復(fù)。較小的質(zhì)粒容易進(jìn)入細(xì)菌，而超螺旋DNA較單切口環(huán)狀DNA更易進(jìn)入細(xì)菌，T4 DNA連接酶與DNA結(jié)合而形成的大分子復(fù)合物以及隨后的超螺旋DNA解旋成為單切口環(huán)狀很可能是T4 DNA連接酶導(dǎo)致電轉(zhuǎn)化效率降低的主要原因[14]，因此，在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中，應(yīng)盡量去除T4 DNA連接酶。

電轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用廣泛，目前對(duì)電轉(zhuǎn)化方面的探索也較多，有研究報(bào)道，感受態(tài)細(xì)胞的濃度、質(zhì)粒的大小及構(gòu)象也會(huì)影響電轉(zhuǎn)化效率[15]，因此，有必要對(duì)電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)條件：在大腸桿菌TG1處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)早期（OD600約為0.4）時(shí)制備電感受態(tài)細(xì)胞，連接產(chǎn)物用乙醇沉淀法去除T4 DNA連接酶后取0.7μg，在電壓2.3 kV、電容25μF、電阻200Ω的條件下采用0.2 cm的電擊杯對(duì)混合后的菌液進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率都可以保證在107CFU/μg DNA左右，最高可達(dá)7.9×107CFU/μg DNA。雖然該轉(zhuǎn)化效率仍然偏低，但基本符合構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)的要求。另外，可通過(guò)多次電轉(zhuǎn)化從而得到更大的抗體庫(kù)庫(kù)容，為后續(xù)抗體的篩選奠定良好平臺(tái)。