梁詩(shī)瑤 劉倩倩 黃勝 顏冬蘭 林麗美 吳萍

〔摘要〕 目的 采用HPLC法測(cè)定六味地黃丸藥渣中丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸的含量，并評(píng)價(jià)六味地黃丸藥渣及單味飲片（熟地黃、澤瀉、牡丹皮、山茱萸）藥渣的體外抗氧化活性。方法 Waters Athena C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.08%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫;柱溫為35 ℃;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;進(jìn)樣量10 μL。采用ABTS法、DPPH法以及FRAP法測(cè)定六味地黃丸藥渣的抗氧化能力。結(jié)果 丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸分別在0.004～0.040、0.078～0.780、0.048～0.480、0.052～0.520 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均加樣回收率分別為103.47%、97.14%、103.92%、100.18%（RSD<3.0%，n=6）。六味地黃丸藥渣和單味飲片藥渣對(duì)DPPH、ABTS自由基清除作用和Fe3+還原能力均較好;其中牡丹皮、山茱萸藥渣的總體抗氧化效果優(yōu)于其他藥渣，二者在低濃度2 mg/mL時(shí)有一定的清除率，且隨著濃度的增加，最高清除率可分別達(dá)到84.51%和76.39%。結(jié)論 該含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，證實(shí)了藥渣中還殘留大量的活性成分，且具有良好的抗氧化生物活性。表明六味地黃丸藥渣具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為藥渣的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 六味地黃丸藥渣;HPLC;丹皮酚;23-乙酰澤瀉醇B;茯苓酸;熊果酸;含量測(cè)定

〔中圖分類號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.010

Determination of Four Active Components in Liuwei Dihuang Pill Residue and Its

Antioxidant Activity

LIANG Shiyao1，2， LIU Qianqian1，2， HUANG Sheng2， YAN Donglan2， LIN Limei1，2*， WU Ping1，2*

（1. Key Laboratory of Hunan Province for Quality Evaluation of Bulk Medicinal MaterialsProduced in Hunan Province， Changsha， Hunan 410000， China; 2. Jiuzhitang Limited Company， Changsha， Hunan 410000， China）

〔Abstract〕 Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of paeonol， 23-acetyl alisol B， poria acid and ursolic acid in Liuwei Dihuang Pill residue， and to evaluate the in vitro antioxidant activity of Liuwei Dihuang Pill residue and dregs of single decoction pieces [Shudihuang （Rehmanniae Radix Praeparata）， Zexie （Alismatis Rhizoma）， Mudanpi （Moutan Cortex）， Shanzhuyu （Corni Fructus）] Methods Waters Athena C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used. Acetonitrile and 0.08% phosphoric acid were used as mobile phase for gradient elution. The column temperature was 35 ℃， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 210 nm， and the injection volume was 10 μL. The antioxidant capacity of Liuwei Dihuang Pill residue was determined by ABTS method， DPPH method and FRAP method. Results The linear relationship of paeonol， 23-acetyl alisol B， poria acid and ursolic acid was good in the range of 0.004～0.040， 0.078～0.780， 0.048～0.480， 0.052～0.520 μg， and the average recovery rate was 103.47%， 97.14%， 103.92% and 100.18% （RSD < 3.0%， n=6）. Liuwei Dihuang Pill residue and dregs of single decoction pieces had good scavenging effect on DPPH， ABTS free radical and Fe3+ reduction ability; the overall antioxidant effect of Mudanpi （Moutan Cortex） and Shanzhuyu （Corni Fructus） residue was better than other drug residues， and they had certain scavenging rate at low concentration （2 mg/mL）， and the highest scavenging rate could reach 84.51% and 76.39% respectively with the increase of concentration. Conclusion The method is accurate and reliable， which proves that there are a lot of active ingredients in the residues. The pharmacological experiments also further verify that the residues of Liuwei Dihuang Pill residue and dregs of single decoction pieces have good antioxidant biological activity. The residue of Liuwei Dihuang Pill have certain nutritional value， which provides the basis for the comprehensive development and utilization of the residue.

〔Keywords〕 Liuwei Dihuang Pill residue; HPLC; paeonol; 23-acetyl alisol B; poria acid; ursolic acid; content determination

隨著中藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，中藥藥渣的排放量在逐年增加，形成了目前既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境的困境。六味地黃丸收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）一部，主要由熟地黃、山藥、澤瀉、山茱萸、牡丹皮和茯苓6味藥材經(jīng)過(guò)提取濃縮而成，具有滋陰補(bǔ)腎之功效，是一個(gè)具有代表性的名優(yōu)中成藥大品種其藥渣每年就可達(dá)3 000噸[1-3]。現(xiàn)代研究[4-5]表明，六味地黃丸主要含有環(huán)烯醚萜類、三萜類及其苷類、甾醇類及揮發(fā)性成分等，具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫、延緩衰老及防癌抗癌等作用。方中牡丹皮含有酚酸類代表性成分丹皮酚，具有抗炎、改善血液流變性、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)缺血組織等多種生物活性[6-7];澤瀉中含有三萜類代表性成分澤瀉醇，其中23-乙酰澤瀉醇B對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、腎炎等疾病有一定療效[8];山茱萸含有馬錢苷、熊果酸等成分，其中熊果酸能選擇性誘導(dǎo)活化型HSC凋亡及抗纖維化機(jī)制，且對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖有明顯抑制作用[9];茯苓中的有效成分茯苓酸具有免疫調(diào)節(jié)活性，體外能減弱由LPS及ConA刺激小鼠脾細(xì)胞的代謝活力[10]。六味地黃丸藥渣中是否還有這些活性成分的保留，值得進(jìn)一步研究。

抗氧化劑能夠減少自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷，能有效抑制疾病的發(fā)生?，F(xiàn)代藥理研究[11]表明六味地黃丸具有抗氧化活性，但是對(duì)其藥渣及各單味飲片藥渣抗氧化活性研究未見報(bào)道。基于此，本文以六味地黃丸藥渣為例，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定六味地黃丸藥渣中丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸4種活性成分的含量;同時(shí)，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）[12-13]自由基清除法和鐵離子還原法（FRAP）對(duì)比分析六味地黃丸藥渣及單味飲片藥渣醇提取物體外抗氧化活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1? 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）;SQP型十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯公司科學(xué)儀器有限公司）;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;Multiskan MK3多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2? 材料

丹皮酚（批號(hào)：wkq20011305）、23-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)：wkq18112311）、熊果酸（批號(hào)：wkq19120908）均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均

≥98%;茯苓酸（批號(hào)：DST200216-001）購(gòu)自德思特生物有限公司，純度≥98%;DPPH（416C021，北京索萊寶科技有限公司）;ABTS試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：S0119）、FRAP試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：S0116）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;乙腈、甲酸為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用六味地黃丸藥渣（九芝堂股份有限公司）曬干粉碎后，過(guò)60目篩，備用。

2 方法

2.1? 含量測(cè)定

2.1.1? 供試品溶液的制備? 精密稱取六味地黃丸藥渣粉末（過(guò)80目篩）約1 g，置具塞錐形瓶中，加入10 mL乙酸乙酯超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 30 min，取出1 500 r/min離心5 min后收集上清液，再加入乙酸乙酯10 mL超聲30 min，離心后合并兩次上清液，將乙酸乙酯揮干后用甲醇溶解稀釋，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用HPLC進(jìn)樣分析。

2.1.2? 對(duì)照品溶液的制備? 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品丹皮酚2.04 mg、熊果酸3.00 mg、茯苓酸1.38 mg，分別置于10 mL的容量瓶中;精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品23-乙酰澤瀉醇B 2.45 mg置于25 mL的容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得各標(biāo)準(zhǔn)品母液的濃度分別為0.204、0.30、0.138、0.098 mg/mL。分別取丹皮酚溶液、熊果酸溶液、茯苓酸溶液、23-乙酰澤瀉醇B溶液0.12、0.87、1.74、4.00 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液濃度分別為0.002、0.026、0.024、0.039 mg/mL，作為混合對(duì)照品溶液。

2.1.3? 色譜條件? 色譜柱：Athena C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.08%磷酸溶液（C），梯度洗脫（0～10 min，5%～65% A;10～40 min，65%～80% A;40～60 min，80%～95% A）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm、210 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.4? 線性關(guān)系考察? 分別精密吸取上述“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸和熊果酸在測(cè)定濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見表1。

2.1.5? 方法學(xué)考察? （1）精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得到丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.17%、0.46%、0.63%、0.67%，表明本法儀器精密度較好。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液10 μL，分別放置0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積積分值，計(jì)算得到丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸峰面積的RSD分別為2.79%、1.86%、1.73%、2.82%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品粉末約0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備平行6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸峰面積的RSD分別為2.41%、1.77%、2.10%、2.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的六味地黃丸藥渣6份（丹皮酚0.020 mg/g、23-乙酰澤瀉醇B 0.934 mg/g、茯苓酸0.294 mg/g、熊果酸0.382 mg/g計(jì)），每份約0.5 g，加入用乙酸乙酯溶液制成的丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸混合對(duì)照品溶液（丹皮酚0.0006 mg/mL、23-乙酰澤瀉醇B 0.0200 mg/mL、茯苓酸0.0150 mg/mL、熊果酸0.0023 mg/mL），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD，測(cè)定并計(jì)算4種待測(cè)成分的平均加樣回收率和RSD值。見表2。

2.2? 抗氧化活性研究

2.2.1? 樣品制備? 分別精密稱取六味地黃丸藥渣和熟地黃、澤瀉、牡丹皮、山茱萸藥渣各100 mg于2 mL的EP試管中，各加1 mL甲醇，超聲提取1 h，冷卻后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到濃度為100 mg/mL的濾液。

2.2.2? 清除DPPH自由基? 準(zhǔn)確稱量DPPH溶液10 mg于250 mL的棕色容量瓶中，甲醇配制，得到濃度為0.04 mg/mL。分別取六味地黃丸藥渣醇提液20 μL至200 μL DPPH中，室溫靜置30 min，515 nm處測(cè)定吸光度結(jié)果為A1，甲醇為試劑空白為A2，DPPH溶液為對(duì)照為A0，Trolox作參比，計(jì)算六味地黃丸藥渣和單味飲片藥渣醇提液對(duì)DPPH自由基的清除率（實(shí)驗(yàn)操作平行3次）。

DPPH自由基的清除率=×100%

2.2.3? 清除ABTS自由基? 在檢測(cè)孔中加入ABTS工作液200 μL，隨后在檢測(cè)孔和對(duì)照孔分別加入10 μL各濃度樣品和10 μL甲醇，輕輕混勻后室溫孵育6 min，在405 nm處吸光度A。以蒸餾水為空白對(duì)照，吸光度為A0，以Trolox作參比，計(jì)算六味地黃丸藥渣和單味飲片藥渣醇提液對(duì)ABTS+自由基的清除率（實(shí)驗(yàn)操作平行3次）。

ABTS自由基的清除率=×100%

2.2.4? FRAP法測(cè)定抗氧化能力? 取27.8 mg FeSO4·7H2O加水定容至1 mL，制成濃度為100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)FeSO4溶液，進(jìn)一步稀釋后得0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，用乙醇為溶劑，分別取5 μL各濃度的藥渣醇提液至180 μL TPTZ工作液中，37 ℃反應(yīng)5 min，在570 nm處測(cè)吸光度。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品，按照上述方法測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品溶液的抗氧化活性。以Trolox作參比（實(shí)驗(yàn)操作平行3次）。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值;采用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1? 共有峰的確定與指認(rèn)

對(duì)六味地黃丸藥渣及單味飲片藥渣建立如圖1所示的指紋圖譜，對(duì)其中的共有峰用對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)，明確了1、2、3、4號(hào)峰分別歸屬于丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸、熊果酸。

3.2? 活性成分含量測(cè)定

精密稱取六味地黃丸藥渣，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)HPLC分析，通過(guò)回歸方程計(jì)算各個(gè)成分的峰面積在藥渣中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，六味地黃丸藥渣中丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸和熊果酸活性成分的含量分別為（0.020±0.002）、（0.928±0.003）、（0.292±0.003）、（0.377±0.006） mg/g。

3.3? 不同濃度六味地黃丸藥渣和單味飲片藥渣醇提液對(duì)DPPH、ABTS自由基清除能力

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，不同濃度六味地黃丸藥渣和熟地黃藥渣、澤瀉藥渣、牡丹皮藥渣、山茱萸藥渣醇提液對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除作用均隨濃度升高而逐漸增強(qiáng)，呈量效關(guān)系。六味地黃丸藥渣在濃度為10 mg/mL以下時(shí)，其清除率均小于50%，無(wú)明顯抗氧化作用;而在25 mg/mL濃度時(shí)，對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用，其清除率達(dá)77.96%，對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)69.29%，抑制效果低于Trolox，且六味地黃丸藥渣有相同濃度下Trolox DPPH和ABTS清除能力的81.40%和72.35%。

3.4? FRAP法測(cè)定不同濃度六味地黃丸藥渣和單味飲片藥渣醇提液抗氧化能力

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，不同濃度六味地黃丸藥渣和單味飲片藥渣醇提液的FeSO4當(dāng)量值均隨濃度升高而逐漸增加，呈量效關(guān)系。六味地黃丸藥渣在濃度為15 mg/mL以下時(shí)，其醇提液的FeSO4當(dāng)量值都比較低，無(wú)明顯抗氧化作用;而在25 mg/mL濃度時(shí)，抗氧化能力較好，其FeSO4當(dāng)量值為1.30 mmol/g，抑制效果低于陽(yáng)性對(duì)照物，總抗氧化能力為相同濃度下Trolox的57.78%。

4 討論

王曉燕等[14]利用HPLC法同時(shí)測(cè)定了六味地黃丸中4種活性成分（莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷和丹皮酚）的含量，其主要集中在環(huán)烯醚萜類化合物上，對(duì)于三萜類成分卻研究較少。故本課題對(duì)六味地黃丸藥渣中丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸和熊果酸4種主要成分同時(shí)進(jìn)行HPLC定量分析，方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，從測(cè)定結(jié)果看，六味地黃丸藥渣中23-乙酰澤瀉醇B和熊果酸含量較高，說(shuō)明藥渣仍有可利用價(jià)值。

3種抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度六味地黃丸藥渣及單味飲片藥渣醇提物不具有抗氧化作用，但隨著其濃度的增加，抗氧化作用不斷增強(qiáng)，呈量效關(guān)系，IC50值是清除率為50%時(shí)的濃度值，其值越小，表明其抗氧化能力越強(qiáng)。由SPSS 21.0計(jì)算各樣品的IC50值大小依次為澤瀉藥渣（16.163）、六味地黃丸藥渣（10.799）、熟地黃藥渣（8.004）、山茱萸藥渣（0.657）、牡丹皮藥渣（0.387），結(jié)果表明，山茱萸、牡丹皮藥渣有較強(qiáng)的抗氧化能力，提示其有一定的價(jià)值。

因此，對(duì)于六味地黃丸藥渣而言，無(wú)論是從其成分方面還是其活性方面，都有其可以進(jìn)行開發(fā)利用的價(jià)值。課題組擬進(jìn)一步考查六味地黃丸藥渣中粗纖維、蛋白等的含量，為其開發(fā)利用提供更加明確的方向。

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