張曉彤，張曉萌，蘇永成，武波飛，劉 姝，盧 靜，楊 光，房耀維

（江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222000）

幾丁質普遍存在于無脊椎動物的外骨骼和角質層，也是構成大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分[1]。全球水產(chǎn)品有機體中約8%富含幾丁質（約占干重的8%～55%），包括蝦、蟹、魷魚、蠔和墨魚等[2-3]。僅在水生生態(tài)系統(tǒng)，幾丁質每年的產(chǎn)量就超過1011噸[4]。在生物體中，幾丁質常與其它結構物質交聯(lián)，在真菌細胞壁中與β-葡萄糖共價結合，在昆蟲等動物中與特定的蛋白質交聯(lián)，形成各種有序結構[5-6]。

幾丁質是自然界中總量僅次于纖維素的天然多糖和可再生聚合物。幾丁質的高結晶度導致其應用受到極大限制[7]。殼聚糖是幾丁質分子中乙?；徊糠只蛉棵摮蟮漠a(chǎn)物，因其分子中有大量游離的氨基，故其溶解性能相比幾丁質得到很大改善，并具有生物可降解性，廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工、印染、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領域，具有很大的開發(fā)和推廣潛力[8-9]。

目前，工業(yè)上制備殼聚糖的方法主要是化學法，即使用濃堿熱解幾丁質脫除乙?；?，容易導致嚴重的環(huán)境污染問題，且獲得的殼聚糖產(chǎn)品中乙?；拿摮潭炔灰恢?，產(chǎn)品均一性差[10]。酶法生產(chǎn)殼聚糖作為一種新型綠色環(huán)保的脫乙酰方法，反應條件溫和，能耗值相對較低，污染小，可獲得脫乙酰程度均一穩(wěn)定的產(chǎn)品[11]。因此，運用幾丁質脫乙酰酶生產(chǎn)殼聚糖成為極具潛力的生產(chǎn)方式[12]。目前國內(nèi)外報道的幾丁質脫乙酰酶產(chǎn)生菌多為真菌，包括Aspergillus nidulans[13]、Schizosaccharomyces pombe[14]、Puccinia graminis[15]、Fusarium proliferatum[16]等。這些菌株發(fā)酵產(chǎn)酶水平較低，催化溫度較高。

海洋具有低溫、高鹽、寡營養(yǎng)等獨特多樣的生態(tài)環(huán)境，蘊含了豐富的能夠產(chǎn)生新穎催化特性酶類的微生物資源。針對目前產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶微生物菌株發(fā)酵水平較低，催化溫度高等問題。本研究組從連云港高公島海域海泥樣品中篩選獲得一株低溫幾丁質脫乙酰酶細菌Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2。本研究對該菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，為工業(yè)化酶法催化幾丁質脫乙酰制備殼聚糖提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

幾丁質 澳新生物工程有限公司；蛋白胨、酵母粉、對硝基-N-乙酰苯胺、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4SO4等試劑均為分析純 上海博微生物科技有限公司；種子培養(yǎng)基（酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，NaCl 1%，陳海水配制，pH7.0）、2216E 培養(yǎng)基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，F(xiàn)ePO40.01%，瓊脂2%，陳海水配制，pH7.0）、發(fā)酵培養(yǎng)基（幾丁質0.5%，酵母粉1%，葡萄糖0.5%，MgSO40.01%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，陳海水配制，pH7.0）實驗室自制；陳海水 取天然海水，室溫靜止兩周后紗布過濾。

高速冷凍離心機 美國SIGMA 公司；分光光度計 杭州明基科學儀器有限公司；SPX-250B-2 生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；Nikon 90i 全電動顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 將保存于超低溫冰箱里的甘油菌株接到2216E 培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)過夜，接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃，140 r/min 搖床培養(yǎng)1 d 后培養(yǎng)得種子培養(yǎng)液，按2%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，于不同發(fā)酵條件下發(fā)酵后，8000×g 離心10 min，上清液過22 μm 濾膜，即為粗酶液[17]。

1.2.2 酶活的測定 根據(jù)Chai 等報道的方法制備對硝基乙酰苯胺標準曲線[10]。試管中加入30 ℃預保溫的0.05 mol/L pH7.0 磷酸緩沖液3 mL，200 mg/L的對硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，粗酶液1 mL，于30 ℃水浴反應15 min，沸水浴終止酶促反應，12000 r/min離心10 min，測定上清液的吸光度（A400)。以添加1 mL 同樣濃度沸水浴滅活15 min 的酶液為對照。酶活單位（U）定義：在上述反應條件下每小時產(chǎn)生對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位[18]。

相對酶活：單因素變量產(chǎn)生的最高酶活為100%，其他因素產(chǎn)生的酶活占最高酶活的比例即為相對酶活（%）。

1.2.3 單因素優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件

1.2.3.1 培養(yǎng)基成分對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵條件：以3%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，以pH7.0、裝液量30%、30 ℃、180 r/min 發(fā)酵48 h 為基本條件，進行幾丁質脫乙酰酶的酶活測定。

碳源的確定：分別添加1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、白砂糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、藕粉。

氮源的確定：分別添加1%的氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、豆粕、米糠、麩皮、黃豆粉、酵母粉。

無機鹽的確定：分別添加0.015%的KCl、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、CuSO4、CoCl2、MgSO4、MnSO4，考察無機鹽對菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶的影響。

1.2.3.2 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)方法：以3%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，以pH7.0、裝液量30%、30 ℃、180 r/min 發(fā)酵48 h 為基本條件，進行幾丁質脫乙酰酶的酶活測定。分別對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝液量、初始pH、轉速進行單因素優(yōu)化。接種量：0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%；裝液量：20%、30%、40%、50%、60%；發(fā)酵溫度：20、25、30、35、40、45、50 ℃；初始pH：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；轉速：100、120、140、160、180、200 r/min；發(fā)酵時間：12、24、36、60、72、84、96、108、120 h。

1.2.4 PB 試驗 在單因素實驗的基礎上，選擇葡萄糖、黃豆粉、MgSO4、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始PH、裝液量、接種量、轉速為考察因素，每個因素設計了高（1）低（-1）2 個水平（表1），運用Design-Expert V8.0.6 軟件進行12 次PB 試驗設計，分別對9 個因素進行數(shù)據(jù)分析，確定影響相對酶活大小的顯著性因素[19]。

表1 Plackett-Burman 試驗因素水平表Table 1 Test factor level of Plackett-Burman

1.2.5 最陡爬坡實驗 在單因素優(yōu)化實驗和PB 試驗的基礎上，對發(fā)酵水平影響顯著的3 個因子，選定基礎發(fā)酵條件，根據(jù)PB 試驗中t 值選定效應方向，設定一定步長，進行最陡爬坡試驗[20]。

1.2.6 響應面法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件 根據(jù)單因素實驗和PB 試驗結果，確定具有顯著性的3 因素為變量，以酶活大小為響應值，運用Design of Experiments設計3 因素3 水平共17 個試驗點的Box-Behnken響應面分析試驗，因素水平表見表2。根據(jù)最陡爬坡試驗選擇因素水平。響應面發(fā)采用多遠二次方程來擬合因素和響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)實驗因素，并對模型進行驗證，以得到菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件[21]。

表2 Box-Behnken 試驗因素水平表Table 2 Test factor level of Box-Behnken

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 每組實驗設3 組平行，重復實驗3 次，實驗結果用平均值±標準方差（n=3）表示，使用Origin2018 作圖，PB 試驗和響應面采用Design Expert 10 進行數(shù)據(jù)分析[21]。

2 結果與分析

2.1 對硝基苯胺的標準曲線

對硝基苯胺標準曲線如圖1 所示，該圖所得線性方程為y=0.0556x+0.00467。該方程決定系數(shù)為0.9997，契合度高。

圖1 對硝基苯胺標準曲線Fig.1 Standard curve of p-nitroaniline

2.2 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶條件單因素優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 碳源對CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響如圖2。碳源為葡萄糖時相對酶活最大，為5.33 U/mL。可溶性淀粉、蔗糖和乳糖的相對酶活在75%以上，玉米淀粉和木薯淀粉的相對酶活較低，因此確定碳源為葡萄糖。前期研究發(fā)現(xiàn)，Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2 所產(chǎn)幾丁質脫乙?；笧榉钦T導酶，即添加幾丁質并不能增加發(fā)酵產(chǎn)酶水平，且?guī)锥≠|不溶于水，作為碳源發(fā)酵水平較低，因此在碳源優(yōu)化中沒有添加幾丁質[17,22]。

圖2 碳源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響圖Fig.2 Effect of carbon source on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.2 氮源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 氮源對CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響如圖3。氮源為酵母粉時酶活產(chǎn)酶水平最高，為5.37 U/mL，黃豆粉和豆粕為氮源時產(chǎn)酶水平達到最高水平的97%和80%，硝酸銨、硫酸銨為氮源時產(chǎn)酶水平較低，可能是無機氮營養(yǎng)單一，而有機氮源富含微生物活動必需的生物因子和微量元素，在生長過程中更易被生物吸收利用或對幾丁質脫乙酰酶本身具有激活作用[9]。由于酵母粉價格昂貴，綜合考慮成本和產(chǎn)酶量，選擇黃豆粉為氮源進行后續(xù)優(yōu)化研究。

圖3 氮源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響圖Fig.3 Effect of nitrogen source on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.3 無機鹽對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 無機鹽對CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響如圖4。無機鹽為MgSO4時相對酶活最大為5.28 U/mL，而MnSO4、CoCl2、CuSO4、FeSO4、KCl 的相對酶活在60%以下，因此無機鹽確定為MgSO4。金屬離子通過影響菌株生長、酶的分泌，以及酶活性從而影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平[7]。

圖4 金屬離子對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響圖Fig.4 Effect of inorganic salt on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.4 接種量對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 接種量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖5。隨著接種量的增加，酶活變大，到2%時產(chǎn)酶最高，最高酶活為5.33 U/mL。接種量大于2%后酶活逐漸變小，因此確定接種量為2%。接種量通過影響發(fā)酵菌株的延遲期，接種量過小，延遲期增長，不利于產(chǎn)酶[12]。

圖5 接種量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.5 Effect of inoculum size on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.5 裝液量對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 裝液量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖6。裝液量30%～40%時產(chǎn)酶較高，裝液量高于40%時，酶活快速下降。裝液量為40%時相對酶活最高，為5.35 U/mL，因此裝液量確定為40%。裝液量較少時，產(chǎn)酶水平較高，隨著裝液量增加，溶氧量降低，降低菌株生長及產(chǎn)酶水平[12]。

圖6 裝液量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.6 Effect of loaded volume on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.6 發(fā)酵溫度對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵溫度對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖7。產(chǎn)酶水平從20 ℃開始隨溫度的升高而增大，在30～35 ℃內(nèi)酶活較高，當發(fā)酵溫度超過35 ℃時，酶活開始迅速下降。35 ℃時產(chǎn)酶最高，酶活為5.435 U/mL，因此發(fā)酵溫度確定為35 ℃。溫度影響微生物生長及代謝，同時影響酶活性，因此對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有明顯影響[23]。

圖7 發(fā)酵溫度對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.7 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.7 培養(yǎng)基初始pH 對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)基初始pH 對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖8。培養(yǎng)基的初始pH 為5.0 或8.0 時，相對酶活較低。但在pH6.5～7.5 時，酶活較高，保持90%以上的酶活。pH 為7.0 時產(chǎn)酶最高，最高酶活為5.41 U/mL，因此初始pH 確定為7.0。

圖8 培養(yǎng)基初始pH 對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.8 Effect of initial pH on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.8 轉速對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 轉速對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖9。當轉速為100 r/min 時產(chǎn)酶較低，轉速為140 r/min 時產(chǎn)酶最高，相對酶活為5.45 U/mL。當轉速140 r/min 以上后，酶活開始迅速下降，因此轉速確定為140 r/min。轉速影響三角瓶內(nèi)的溶氧，從而影響菌株的生長和發(fā)酵產(chǎn)酶水平[12]。

圖9 轉速對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of the speed of centrifugal on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.9 發(fā)酵時間對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵時間對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖10。隨著發(fā)酵時間的進一步增加，相對酶活先上升后呈下降趨勢。發(fā)酵時間84 h 產(chǎn)酶最高，最高酶活為5.61 U/mL，因此發(fā)酵時間確定為84 h。

圖10 發(fā)酵時間對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of ferrnentation time on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.3 PB 試驗設計優(yōu)選影響酶活大小的顯著因素

在單因素實驗的基礎上，選擇葡萄糖、黃豆粉、MgSO4、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量、轉速為考察因素，每個因素設計了高（1）低（-1）2 個水平（表1），運用Design-Expert V8.0.6軟件進行12 次PB 試驗設計（見表3），分別對9 個因素進行數(shù)據(jù)分析，確定影響相對酶活大小的顯著性因素[22]。

表3 Plackett-Burman 試驗設計與結果Table 3 Plackett-Burman experimental design and results

運用Design-Expert V8.0.6 軟件對表3 中數(shù)據(jù)進行顯著性試驗，結果見表4。由表4 可知，MgSO4、發(fā)酵溫度、葡萄糖對相對酶活大小影響均顯著，且顯著性大小排序為MgSO4（X3）＞發(fā)酵溫度（X5）＞葡萄糖（X1）；其他因素對相對酶活大小的影響不顯著。因此選擇MgSO4（X3）、發(fā)酵溫度（X5）、葡萄糖（X1）作為響應面模型的考察因素。

表4 Plackett-Burman 試驗設計方差分析Table 4 Plackett-Burman analysis of variance of test design

2.4 最陡爬坡實驗結果分析

Plackett-Burman 實驗可以選擇出對發(fā)酵水平影響顯著的因子，但是不能預測變量的最佳水平，因此，設計最陡爬坡實驗，以確定重要因素的最佳水平領域[24]。實驗結果見表5。3 個重要因素在第2 組水平，酶活性達到最大值，隨后隨著數(shù)值的增加，酶活性下降，因此，選定第2 組因素水平進行響應面優(yōu)化。

表5 最陡爬坡實驗設計及結果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.5 響應面法優(yōu)化菌株CDA2-2-2 產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶的發(fā)酵條件

2.5.1 響應面設計及結果 根據(jù)PB 試驗結果確定優(yōu)選的MgSO4（A）、發(fā)酵溫度（B）、葡萄糖（C）3 個因素為變量，以酶活大小為響應值，運用Design of Experiments 設計3 因素3 水平共17 個試驗點的Box-Behnken 響應面分析試驗（表6）。

表6 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 6 Box-Behnken test design and results

2.5.2 試驗數(shù)據(jù)分析 對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二次多項式方程：

由表7 可知：從F值的大小可以得到，一次項中各因素對幾丁質脫乙酰酶酶活的影響順序是B＞C＞A。對幾丁質脫乙酰酶酶活的方差分析可得模型P＜0.01，表明該方程模型極顯著，不同處理間的差異性極顯著；失擬項P＞0.05，表明模型失擬項不顯著；模型的R2為0.965，說明該模型能解釋96.5%響應值的變化，因而該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以用于預測最優(yōu)發(fā)酵條件參數(shù)[25]。

表7 幾丁質脫乙酰酶酶活的回歸方差分析表Table 7 Regression analysis of variance of chitinic deacetylase activity

響應面三維圖11 表明，響應面開口朝下，響應值隨各自變量的值先增加后減少，說明此模型有突出穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點是該模型的最大值。葡萄糖0.5%，當MgSO4在0.015%～0.022%，發(fā)酵溫度在35.5～37.5 ℃時酶活最大；發(fā)酵溫度35 ℃時，當MgSO4在0.015%～0.023%，葡萄糖0.53%～0.59%，酶活力最大；MgSO40.1%時，發(fā)酵溫度在35.5～38 ℃，葡萄糖0.53%～0.59%，酶活最大。

圖11 MgSO4、發(fā)酵溫度、葡萄糖的交互作用對幾丁質脫乙酰酶酶活的影響圖Fig.11 Effects of MgSO4,fermentation temperature and glucose interaction on enzyme activity

2.5.3 驗證性實驗 使用響應面法對發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化[24]，得到最佳培養(yǎng)基組合為：MgSO40.01%、發(fā)酵溫度37.76 ℃、葡萄糖0.57%，發(fā)酵產(chǎn)酶活預測值為14.2932 U/mL。為了保證試驗的方便可行，對各個條件做少許修正進行驗證實驗，MgSO40.01%，發(fā)酵溫度38 ℃，葡萄糖0.57%進行驗證試驗，結果顯示幾丁質脫乙酰酶酶活為14.582 U/mL，與理論值相對誤差＜5%，較優(yōu)化前提高了2.5 倍，優(yōu)化后菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶水平為14.582 U/mL，高于部分報道的細菌發(fā)酵幾丁質脫乙酰酶的發(fā)酵水平[5，25]，說明響應面分析得到的模型準確可靠且具有實用性。

3 結論

采用優(yōu)化發(fā)酵條件提高海洋Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質脫乙酰酶水平，在考察了單因素對相對酶活影響的基礎上，運用PB 實驗設計篩選出顯著性影響因素，確定顯著性影響因素為MgSO4、發(fā)酵溫度、葡萄糖。使用響應面法對發(fā)酵工藝條件進一步優(yōu)化獲得最佳培養(yǎng)基組合為：MgSO40.01%、發(fā)酵溫度38 ℃、葡萄糖0.57%。在此條件下，幾丁質脫乙酰酶水平較優(yōu)化前提高了2.5 倍，達到14.58 U/mL。本研究僅通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高產(chǎn)酶水平，進一步研究可通過誘變育種進一步提高發(fā)酵水平，以及對酶基因進行克隆和高效表達和定性進化研究，提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，提高酶的比活力和催化晶體幾丁質的活性。