林 杰，鄭 晶，柯 璐，徐 珊，陳 彬，張溫玲，曾維楊

(福州海關(guān)技術(shù)中心//福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003)

菌落總數(shù)是用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品作出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣，因此菌落總數(shù)在食品原料、加工過(guò)程以及成品的微生物檢驗(yàn)中作為衛(wèi)生指標(biāo)菌需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)[1-3]。由于商品化測(cè)試片方法具有簡(jiǎn)便、易于識(shí)別菌落、可以節(jié)約大量培養(yǎng)基配制和操作時(shí)間，因此近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用，相關(guān)產(chǎn)品也有不少[4-7]。3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2016比較，培養(yǎng)時(shí)間從48 h縮短到24 h，能更快出具結(jié)果，以便于更快地判定食品的安全性。為了更加科學(xué)規(guī)范的使用測(cè)試片，根據(jù)SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》和SN/T 2775—2011《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》的要求，對(duì)3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片進(jìn)行評(píng)價(jià)試驗(yàn)，評(píng)估其在食品中菌落總數(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：弗氏檸檬酸桿菌 ATCC8090、大腸桿菌ATCC8739、金黃色葡萄球菌ATCC6538、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778、奇異變形桿菌 ATCC43071，均購(gòu)自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基， 3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片，營(yíng)養(yǎng)肉湯，生理鹽水。

1.2 儀器與設(shè)備

KD-TBC-300M電子天平，福建科迪技術(shù)有限公司；Stomacher3500拍擊式均質(zhì)器，英國(guó)SEWARD；恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)BINDER。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株及菌懸液的制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株弗氏檸檬酸桿菌ATCC8090、大腸埃希氏菌ATCC8739、金黃色葡萄球菌ATCC6538、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778、奇異變形桿菌 ATCC43071分別復(fù)活后，混合接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中， 37℃混合培養(yǎng) 18～24 h備用。

1.3.22種方法對(duì)比線性和準(zhǔn)確度

根據(jù)SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》和SN/T 2775—2011《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》的要求，選擇5類15種樣品進(jìn)行試驗(yàn)。其中選擇8種自然污染樣品進(jìn)行試驗(yàn)，另外選擇7種樣品進(jìn)行人工污染，將1.3.1混合培養(yǎng)液以適當(dāng)?shù)谋壤♂尯?，按高、中、?個(gè)接種水平添加到樣品中混勻制備成測(cè)試樣品，2個(gè)水平之間差一個(gè)數(shù)量級(jí)。每種樣品同時(shí)按照3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片方法和GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)，自然污染樣品結(jié)果見(jiàn)表1，人工污染樣品結(jié)果見(jiàn)表2。

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 7種人工污染樣品兩種方法測(cè)試結(jié)果

續(xù)表2

1.3.3測(cè)試片耐變性

耐變性是指對(duì)同一樣品用一個(gè)分析方法，在各種正常檢測(cè)條件下進(jìn)行分析，保證該分析方法的可行性。耐變性評(píng)價(jià)由以下步驟組成：確定可能影響檢測(cè)結(jié)果的因素，對(duì)每一種因素稍作改變，采用合適的方法進(jìn)行耐變性檢驗(yàn)。對(duì)于菌落總數(shù)檢測(cè)而言，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間是2個(gè)主要影響因素，因此選用2個(gè)污染水平純牛奶樣品對(duì)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間兩個(gè)變量進(jìn)行耐變性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

1.3.4測(cè)試片批間變異

為了驗(yàn)證測(cè)試片的穩(wěn)定性，取3個(gè)不同批號(hào)測(cè)試片對(duì)2個(gè)污染水平奶粉樣品進(jìn)行批間變異試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

1.3.5實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同試驗(yàn)

選用牛奶樣品，添加弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、奇異變形桿菌等 5種菌混合培養(yǎng)物，制備成高、中、低3個(gè)接種水平的凍干樣品，發(fā)送8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同試驗(yàn)。每一接種水平樣品同時(shí)用測(cè)試片方法和參考方法進(jìn)行測(cè)試，每一接種水平樣品做5個(gè)平行，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7和表8。

2 結(jié)果和分析

2.1 線性和準(zhǔn)確度

微生物學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)通常不是正態(tài)分布的，為了獲得更加對(duì)稱的分布，所以將計(jì)數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)形式，比較測(cè)試片方法與參考方法的一致性。

對(duì)每種食品2種方法的測(cè)試結(jié)果作回歸曲線圖，得出線性方程和相關(guān)系數(shù)，以考察測(cè)試片方法與參考方法的相關(guān)性。用t檢驗(yàn)比較2種方法的差異性，結(jié)果見(jiàn)表3。用標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表4 。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)和t值

表4 重復(fù)性分析結(jié)果

續(xù)表4

從表3可見(jiàn)，5類15種食品相關(guān)系數(shù)均大于0.97，t值均小于t0.05(15)=2.131，說(shuō)明3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片方法和參考方法GB 4789.2—2016無(wú)顯著性差異。從表4可見(jiàn)5類15種食品測(cè)試片法的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.009～0.093，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.25%～5.21%；參考方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.008～0.100，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.30%～5.67%。兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差無(wú)顯著差異，可以說(shuō)明3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片方法準(zhǔn)確度較高。

2.2 測(cè)試片耐變性

耐變性試驗(yàn)及分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 耐變性試驗(yàn)及分析結(jié)果

經(jīng)驗(yàn)證，培養(yǎng)溫度選擇35℃和37℃，培養(yǎng)時(shí)間選擇22 h和26 h對(duì)檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s與在重復(fù)性條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差s無(wú)顯著差異，表明測(cè)試片對(duì)培養(yǎng)溫度36±1℃和培養(yǎng)時(shí)間24±2 h的耐變性范圍不影響檢測(cè)結(jié)果。

2.3 測(cè)試片批間變異

批間變異試驗(yàn)及分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 批間變異試驗(yàn)及分析結(jié)果

三個(gè)不同批號(hào)測(cè)試片測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s與在重復(fù)性條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差s沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明不同批號(hào)產(chǎn)品無(wú)顯著差異。

2.4 實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同試驗(yàn)

協(xié)同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性分析結(jié)果見(jiàn)表7和表8。

表7 協(xié)同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性分析結(jié)果

表8 協(xié)同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性和再現(xiàn)性結(jié)果

經(jīng)柯克倫檢驗(yàn)剔除離群值后統(tǒng)計(jì)協(xié)同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性和再現(xiàn)性[8]，8家實(shí)驗(yàn)室對(duì)高、中、低3個(gè)接種水平樣品的5個(gè)平行測(cè)試，結(jié)果2個(gè)方法的重復(fù)性值r和再現(xiàn)性值R比較接近，說(shuō)明2種測(cè)試方法無(wú)顯著差異。

3 結(jié)論

通過(guò)5大類15種食品2種檢測(cè)方法的比對(duì)試驗(yàn)，重復(fù)性結(jié)果和統(tǒng)計(jì)t檢驗(yàn)結(jié)果，以及8家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和再現(xiàn)性分析，均說(shuō)明3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2016在食品檢測(cè)上無(wú)顯著性差異。耐變性結(jié)果表明，測(cè)試片在檢測(cè)的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響；批間變異結(jié)果表明不同批號(hào)測(cè)試片的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明測(cè)試片穩(wěn)定性良好。綜上所述， 3M PetrifilmTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，產(chǎn)品性能穩(wěn)定，能滿足食品菌落總數(shù)的檢測(cè)要求。