王子豪，趙麗瑩，孟 鑫

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

隨著日常飲食水平的提高，人類患高脂血癥的概率也愈發(fā)增高[1]。高脂血癥會(huì)引發(fā)一系列危害人類健康生活的疾病，例如冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)約有40%的致死病和這類疾病有關(guān)，是嚴(yán)重威脅人類健康的殺手[3]。研究表明，食用富含單不飽和脂肪酸的食物，能夠降低高脂血癥患者的血脂含量[4]。研究單不飽和脂肪酸對(duì)血脂代謝的影響，通過(guò)控制飲食中脂肪酸的比值，使人體血脂含量保持較低的水平具有十分重要的意義[5-8]。油酸屬于一類化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的單不飽和脂肪酸[9]，課題組前期已經(jīng)構(gòu)建了產(chǎn)油酸的重組大腸桿菌，然而重組油酸對(duì)于血脂代謝的影響還處于探索階段。為此，本實(shí)驗(yàn)以重組油酸飼喂高脂血癥模型小鼠，通過(guò)血清指標(biāo)檢測(cè)，考察重組油酸對(duì)小鼠血脂代謝的影響，以期開(kāi)發(fā)一種優(yōu)質(zhì)單不飽和脂肪酸資源，進(jìn)一步為改善和研發(fā)人類健康膳食奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

5周左右，體重為23～26 g的雄性昆明小鼠(SPF級(jí))25只，購(gòu)于錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)在溫度控制為20～22℃，通風(fēng)、光照的鼠房中。

血清指標(biāo)檢測(cè)試劑盒(TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè)試劑盒)，均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；IPTG、M9基本培養(yǎng)基購(gòu)于上海美迪西生物醫(yī)藥公司；血糖儀購(gòu)于通化海恩達(dá)高科技股份有限公司；甲醇、氯仿購(gòu)于北京全式金生物有限公司；蛋黃粉、膽固醇、膽酸鈉、豬油購(gòu)于恒盛化工有限公司；基礎(chǔ)飼料購(gòu)買(mǎi)于錦州醫(yī)科大學(xué)；高脂飼料由70%基礎(chǔ)飼料15%豬油、8%蛋黃粉、5%膽固醇和2%膽酸鈉組成；重組菌CYJ1為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SJ-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、PLATILAB340(STD)低溫冰箱，上海安亭科學(xué)儀器廠；TG16A高速離心機(jī)、WD2098B酶標(biāo)儀、UV系列分光光度計(jì)，常州市科學(xué)儀器有限公司；TS-100B恒溫?fù)u床，常州中北儀器有限公司；LK系列電子天平，朗科電子儀器有限公司。

1.3 重組菌的培養(yǎng)

采用M9基本培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌CYJ1，在37℃溫度下，振蕩培養(yǎng)6～8 h后，用分光光度計(jì)測(cè)得OD600約為0.4，然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)直至終濃度為0.1 mM，誘導(dǎo)重組菌內(nèi)目的基因fabA、fabB的表達(dá)。利用氯仿-甲醇(2∶1)抽提法，離心收集提取大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的總脂后，經(jīng)GC-MS檢測(cè)，油酸約占總脂肪酸含量的40%～60%，用來(lái)灌胃小鼠。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的設(shè)計(jì)

25只昆明小鼠(SPF級(jí))飼養(yǎng)在光照、通風(fēng)，溫度為20℃左右的環(huán)境中，隨機(jī)分為5組，每組5只：(空白對(duì)照組、高脂模型組、低劑量油酸組、中劑量油酸組、高劑量油酸組)。飼喂基礎(chǔ)飼料1周后，空白對(duì)照組：喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料+每天灌胃5 g/kg蒸餾水；高脂模型組：喂養(yǎng)高脂飼料+每天灌胃5 g/kg豬油；低劑量油酸組：喂養(yǎng)高脂飼料+每天灌胃2.5 g/kg油酸；中劑量油酸組：喂養(yǎng)高脂飼料+每天灌胃5 g/kg油酸；高劑量油酸組：喂養(yǎng)高脂飼料+每天灌胃10 g/kg油酸。各組小鼠自由飲食飲水直至灌胃結(jié)束。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1小鼠糞便和外形的觀察

每天觀察各組小鼠的毛發(fā)狀況，并觀察每組小鼠所產(chǎn)生糞便的形狀。

1.5.2體重的稱量

在實(shí)驗(yàn)前后分別稱量各組小鼠體重，記下數(shù)據(jù)。

1.5.3血清指標(biāo)

飼喂35 d后所有小鼠禁食不禁水12 h斷剪尾部取血，用血糖儀測(cè)定空腹血糖值(FBG)的大小。隨后摘眼球取血放入裝有抗凝劑的EP管中靜置一段時(shí)間，以3 000 r/min離心15 min，收集小鼠血清并參照試劑盒上的方法檢測(cè)其中TC、TG、LDL-C、HDL-C各指標(biāo)。

1.5.4肝臟指標(biāo)

1.5.5數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 油酸對(duì)小鼠毛發(fā)和糞便的影響

空白組小鼠毛發(fā)柔順，糞便干硬較小，結(jié)構(gòu)比較完整；其他組小鼠毛發(fā)比較直立、出油，糞便較粗、軟且稀。其中高脂模型組小鼠毛發(fā)出油率最明顯。說(shuō)明油酸對(duì)于高脂飼料攝入引起的毛發(fā)出油有輕微的抑制作用。但是從外觀上無(wú)法確認(rèn)哪種劑量的油酸作用最顯著。

2.2 油酸對(duì)小鼠體重變化的影響

由表1可知，在實(shí)驗(yàn)前，每組小鼠體重沒(méi)有明顯的差異(P>0.05)，說(shuō)明選購(gòu)的各小鼠生活良好，無(wú)不良反應(yīng)。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前后的體重變化表明，高脂模型組>高劑量油酸組>中劑量油酸組>低劑量油酸組>空白對(duì)照組，其中高脂模型組小鼠體重變化相較于空白對(duì)照組，均有顯著性差異(P<0.05)，油酸組小鼠的體重變化與高脂模型組相比，均有顯著性降低(P<0.05)。分析其原因有兩點(diǎn)，一是油酸在一定程度上能夠降低由于高脂飲食而導(dǎo)致的體重增加；二是由于每天對(duì)小鼠灌胃油酸可能對(duì)小鼠正常飲食產(chǎn)生了抑制的作用。然而，高劑量油酸組體重變化明顯高于其他兩個(gè)劑量組，說(shuō)明油酸攝入過(guò)多并不利于體重的減少。

表1 實(shí)驗(yàn)前后小鼠體重的變化

2.3 油酸對(duì)小鼠的FBG的影響

由圖1可知，與空白組小鼠相比，其他4組小鼠FBG含量都有顯著上升(P<0.05)；與高脂組相比，油酸組FBG含量均有所下降，其中，高劑量油酸組下降最明顯。說(shuō)明重組油酸可能通過(guò)干預(yù)小鼠飲食或其他途徑降低由于高脂飲食而引起的血糖升高。

圖1 小鼠的FBG含量

2.4 油酸對(duì)小鼠血清中血脂的影響

由表2可知，高脂模型組相較于空白對(duì)照組，小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均有明顯升高，而HDL-C明顯下降(P<0.05)，表明高脂血癥模型建立成功。油酸組相較于高脂模型組，小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量均有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明油酸可以改變由于飲食而引起的血清指標(biāo)。其中，中劑量油酸組小鼠較高脂組，血清中TC、TG、LDL-C含量較高脂組均顯著性降低，HDL-C顯著性升高(P<0.05)；低劑量油酸組TG、LDL-C、HDL-C沒(méi)有明顯差異(P>0.05)，高劑量油酸組LDL-C、HDL-C無(wú)明顯差異(P>0.05)，所以，中劑量油酸組對(duì)高血脂癥作用效果最明顯。說(shuō)明重組菌CYJ1提取的油酸，能夠改善血清中的各項(xiàng)指標(biāo)，從而降低高脂血癥的發(fā)生。油酸作為一類單不飽和脂肪酸，其降血脂的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)脂代謝基因(如PPAR、HMG-COA)從而抑制膽固醇的合成，也可能直接作用于肝細(xì)胞，抑制肝細(xì)胞合成脂質(zhì)。關(guān)于油酸降血脂的機(jī)制還處于發(fā)展階段，需要進(jìn)一步從分子水平或細(xì)胞水平上準(zhǔn)確解析出降血脂的機(jī)制。

表2 油酸對(duì)小鼠血脂水平的影響

2.5 油酸對(duì)小鼠肝臟指標(biāo)的影響

由表3可知，與空白對(duì)照組相比較，其它幾組的肝臟體積比均有顯著性增加，說(shuō)明長(zhǎng)期攝入高脂飼料會(huì)使肝臟脂肪沉積導(dǎo)致肝臟體重增加。與高脂模型組相比，中劑量和高劑量油酸組的肝臟體積比顯著降低，說(shuō)明適量的油酸會(huì)減少脂肪肝的沉積，從而降低高脂血癥的發(fā)生。

表3 油酸對(duì)小鼠肝臟體積比的變化

3 討論

由此可見(jiàn)，重組菌CYJ1誘導(dǎo)產(chǎn)生的油酸能夠有效降低小鼠血脂血糖水平，改善由于飲食而導(dǎo)致的高脂血癥和肥胖，對(duì)高脂血癥和動(dòng)脈硬化具有較好的預(yù)防作用。因此，可以作為一種優(yōu)質(zhì)的油酸來(lái)源，添加到食品工業(yè)或飼料工業(yè)中，作為改善由于飲食而引起的高脂血癥的功能性食品或輔料，具有重要的科學(xué)價(jià)值和前景。

4 結(jié)論

高脂血癥是由于血清中甘油三酯和膽固醇等指標(biāo)的升高，從而引發(fā)的血脂異常疾病[10]。本研究通過(guò)對(duì)重組大腸桿菌誘導(dǎo)，產(chǎn)生油酸，然后對(duì)小鼠喂食高脂飲食建立高脂模型。建模成功后，對(duì)小鼠分組并利用重組菌產(chǎn)生的油酸灌胃進(jìn)行飲食干預(yù)。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)相較于高脂模型組，油酸組小鼠的體重顯著性降低，且油酸能明顯降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，以及血糖水平和肝臟體積比，增加HDL-C含量，其中中劑量油酸組(5 g/kg)效果最明顯。