高 傲，劉 宇，宋慶港，谷彤彤，廖燕玲，榮成博**

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京100097；2.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色533000）

雞腿菇（Coprinus comatus） 學(xué)名毛頭鬼傘，屬于層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 鬼傘科 （Psathyrellaceae） 鬼傘屬 （Coprinus）[1]。雞腿菇子實體潔白、肉質(zhì)細(xì)嫩可口、營養(yǎng)豐富，同時雞腿菇還具有較好的保健和藥用價值[2]。研究表明，雞腿菇具有抗氧化、降血糖、降血脂、防止肝損傷、抗腫瘤、提高免疫力、抑菌等功效，是一種藥食同源并極具開發(fā)前景的食用菌[3－6]。段懿涵等[4]研究發(fā)現(xiàn)，雞腿菇多糖對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有較好的抗氧化活性，可起到降血糖作用。秦楠等[6]研究表明雞腿菇菌絲發(fā)酵液具有抗枯草芽孢桿菌的能力，同時還具有抗氧化活性。崔旻等[7]研究發(fā)現(xiàn)，雞腿菇多糖可以增加T淋巴細(xì)胞數(shù)量，并對人肝癌細(xì)胞SMMC－7721的體外增殖有一定抑制作用。另外雞腿菇由于其外形獨特，在觀光采摘園區(qū)也備受青睞，因此雞腿菇是近年開發(fā)的較具商業(yè)潛力的珍稀菌品，被譽為“菌中新秀”。

鑒于雞腿菇在食用菌產(chǎn)業(yè)中具有重要潛力，該品種的育種也逐漸受到重視。食用菌種質(zhì)資源是優(yōu)良品種育種的基礎(chǔ)材料，育種成效除了取決于種質(zhì)資源的數(shù)量，還很大程度取決于對種質(zhì)資源多樣性的遺傳特性掌握。分子標(biāo)記作為食用菌遺傳多樣性研究中的重要手段，其應(yīng)用越來越廣泛[8]。

簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter－simple sequence repeats，ISSR） 是Zietkiewicz等[9]于1994年創(chuàng)建的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，根據(jù)基因組中廣泛存在的微衛(wèi)星序列，設(shè)計通用引物對基因組DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，從而檢測基因組中微衛(wèi)星序列的變異，該技術(shù)具有重復(fù)性高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，在食用菌中得到廣泛應(yīng)用。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP） 技術(shù)通過對外顯子區(qū)域和內(nèi)含子、啟動子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從而使個體間產(chǎn)生多態(tài)性，近年來廣泛應(yīng)用在種群遺傳多樣性的分析中[10]。

由于不同的分子標(biāo)記技術(shù)通過聚類分析產(chǎn)生的結(jié)果有所差異，因此本研究采用ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行綜合運用以優(yōu)化聚類分析結(jié)果，將收集到的22個雞腿菇樣本進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，為雞腿菇的鑒定、遺傳育種及分類提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

本試驗所用雞腿菇菌株的名稱及相關(guān)信息見表1。

表1 雞腿菇樣本及其來源Tab.1 Coprinus comatus samples and sources

1.1.2 試驗試劑

葡萄糖、MgSO4購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4購自西隴科學(xué)股份有限公司；瓊脂粉、大豆蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；VB1購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；三氯甲烷購自北京化工廠；2X Taq PCR Master mix購自北京永澤浩嘉生物技術(shù)發(fā)展中心；瓊脂粉購自Life Technologies公司；試驗引物由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。

1.1.3 儀器

Bio－Rad S1000 PCR 儀、Bio－Rad ChemiDocTMMP紫外凝膠成像系統(tǒng)、北京六一DYY－III－12B電泳儀、奧豪斯FR224CN電子分析天平、Eppendorf 5430R臺式高速冷凍離心機(jī)等。

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA綜合培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂粉 20 g、大豆蛋白胨 5 g、VB110 mg，ddH2O 1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR 擴(kuò)增

在PDA綜合培養(yǎng)基平板上活化22個雞腿菇菌種7 d～10 d，使用天根生化科技（北京） 有限公司植物DNA提取試劑盒（DP305） 進(jìn)行DNA的提取。ISSR擴(kuò)增體系以及擴(kuò)增方法參照武海月等[8]的方法，ISSR－PCR 反應(yīng)總體積 20 μL，體系為：10 μL2×Taq PCR Master mix，10 μL 的 ddH2O，引物為 1 μL，模板為1 μL。將反應(yīng)液加入PCR管進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表2。

表2 ISSR引物序列Tab.2 ISSR Primer sequence

ISSR-PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性4 min，后94℃變性30 s，以低于引物退火溫度5℃復(fù)性45 s，72℃延伸 2 min，共 35個循環(huán)；72℃延伸 7 min，4℃保存。

SRAP-PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增方法參照武海月等[8]方法，其中Me為正向引物，Em為反向引物，SRAP-PCR反應(yīng)總體積20 μL，體系為：10 μL的2×Taq PCR Master mix，10 μL的 ddH2O，引物 F為 1 μL，引物R為1 μL，模板為1 μL。將反應(yīng)液加入PCR管進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表3。

表3 SRAP引物序列Tab.3 SRAP Primer sequence

SRAP-PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性7 min，后94℃變性 1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，5個循環(huán)；后 94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 90 s，共38個循環(huán)；最后 72℃延伸 10 min，4℃保存。

使用1×Tris-乙酸（TAE） 配置的2%瓊脂糖凝膠，130 V瓊脂糖凝膠電泳約40 min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

將上述電泳圖中同一水平上的可見條帶標(biāo)記為“1”，未擴(kuò)增出條帶標(biāo)記為“0”，用NTSYSpc 2.10軟件分析。

2 結(jié)果分析

2.1 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

以濃度一致的22株供試雞腿菇菌株的基因組DNA為模板，通過對不同引物的篩選最終選出24條ISSR引物在供試菌株上擴(kuò)增效果良好，每個菌株均可擴(kuò)增出多條DNA條帶，條帶清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好。ISSR引物842對22個雞腿菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

由圖1所示，以引物842的擴(kuò)增結(jié)果為例，不同的引物擴(kuò)增條帶數(shù)不同，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200 bp～2 000 bp，包含了豐富的多態(tài)性信息。

圖1 引物842的22株雞腿菇菌株擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of 22 Coprinus comatus strains with primer 842

2.2 SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果

以濃度一致的22株供試雞腿菇菌株的基因組DNA為模板，通過對不同引物的篩選最終選出24對SRAP引物在目標(biāo)菌株上擴(kuò)增效果良好，每個菌株均可擴(kuò)增出多條DNA條帶。引物Me1/Em4對22株雞腿菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

由圖2所示，篩選出的引物擴(kuò)增出條帶為3條～13條，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200 bp～2 000 bp。

圖2 引物Me1/Em4的22株雞腿菇菌株擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification results of 22 Coprinus comatus strains by primer Me1/Em4

2.3 多態(tài)性分析

統(tǒng)計32個電泳圖的條帶，記錄為0或者1。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果計算出每種引物擴(kuò)增出的條帶總數(shù)、每種DNA擴(kuò)出的條帶數(shù)量、每種引物對應(yīng)的多態(tài)性條帶數(shù)量、多態(tài)性條帶數(shù)量比例。24條ISSR引物和24對SRAP引物的多態(tài)性分析結(jié)果見表4、表5。

表4 24條ISSR引物的多態(tài)性表Tab.4 Polymorphism table of 24 ISSR primers

由表4、表5可知，24條ISSR引物共擴(kuò)增出條帶219條，其中多態(tài)性條帶204條，多態(tài)性占比93.1%。24對SRAP引物共擴(kuò)增出條帶149條，其中多態(tài)性條帶127條，多態(tài)性占比85.2%。24條ISSR引物和24對SRAP引物共擴(kuò)增出368條DNA片段，其中多態(tài)性條帶有331條，多態(tài)性比例為50%～100%，說明22株雞腿菇遺傳多樣性比較豐富；不同引物擴(kuò)增出每種DNA的條帶數(shù)量為2條～13條，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200 bp～2 000 bp，包含了豐富的多態(tài)性。

表5 24對SRAP引物的多態(tài)性表Tab.5 Polymorphism table of 24 pairs of SRAP primers

2.4 聚類分析結(jié)果

根據(jù)ISSR和SRAP的結(jié)果綜合進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 22株雞腿菇菌株聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram on 22 Coprinus comatus strains

根據(jù)圖3聚類分析結(jié)果可知，在相似系數(shù)為0.8水平上，可將22株供試雞腿菇菌株分為4大類，表明22株供試雞腿菇菌株間具有較大的遺傳差異，第1 類 包 括 JZB2108001、 JB2108007、 JB2108009、JB2108003、 JB2108006、 JB2108010、 JB2108011、JB2108013、 JB2108014、 JB2108019、 JB2108005；第 2類包括 JB2108015、JB2108016、JB2108020、JB2108022、 JB2108025、 JB2108030、 JB2108028、JB2108029；第 3類包括 JB2108017；第 4類為JB2108012、JB2108023。而在0.97的相似系數(shù)水平上，除JB2108015和JB2108016兩個菌株未區(qū)分開外，其余20株菌株均可單獨分開。

2.5 主坐標(biāo)分析

將條帶統(tǒng)計結(jié)果用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，通過對22株雞腿菇的相似系數(shù)矩陣進(jìn)行中心化處理，主成分分析表明二維圖前2個主坐標(biāo)分別解釋總遺傳變異的27.28%、15.15%，占總遺傳變異的42.43%。主坐標(biāo)分析與聚類分析相一致，將22株雞腿菇分為了四類。

圖4 22株雞腿菇聚類散點圖Fig.4 Clustering scatter diagram on 22 Coprinus comatus strains

2.6 不同雞腿菇的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分析

22株雞腿菇樣本個體間的遺傳距離為0.030 0～0.850 3，平均值為 0.316 9。其中，JZB2108017 與JZB2108023之間遺傳遺傳距離最大為0.850 3，其次是JZB2108020與JZB2108023遺傳距離為0.826 9，而JZB2108015與JZB2108016遺傳距離最小為0.030 0，其次為 JZB2108007與 JZB2108009的遺傳距離為0.149 7。22雞腿菇樣本中個體間的遺傳相似系數(shù)為 0.149 7～0.970 0，平均值為 0.683 0。其中，JZB2018015與JZB2108016之間遺傳相似系 數(shù)最大為 0.970 0， 其次是 JZB2108007與JZB2108009遺傳相似系數(shù)為0.945 9，而JZB2108017與 JZB2108023遺傳相似系數(shù)最小為 0.149 7，其次為JZB2108023與JZB2108011遺傳相似系數(shù)為 0.155 6。

綜上所述，JZB2108015與JZB2108016親緣關(guān)系最近，JZB2108017與JZB2108023親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

目前食用菌行業(yè)里菌種混亂，同種異名和同名異種現(xiàn)象嚴(yán)重，這極大地限制了食用菌行業(yè)的發(fā)展。傳統(tǒng)的鑒別主要是在子實體層面對子實體的顏色、大小、外形等形態(tài)特征及其生理生化特征、生長速度等進(jìn)行鑒別，該方法耗費時間長，準(zhǔn)確率較低，易受外界環(huán)境因素影響，只能鑒定屬內(nèi)種水平[8]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，已有多種分子標(biāo)記方法被應(yīng)用到食用菌的分類鑒定當(dāng)中。朱靜嫻等[11]利用38對引物對23株大球蓋菇基因組DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增分析，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.84時，23株大球蓋菇供試菌株被分為3個類群，多個地理位置相距較近的菌株在同一進(jìn)化支上，表明遺傳相似性與其地理位置有一定的相關(guān)性。李紅等[12]利用9條引物對16個滑菇菌株基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，在遺傳相似系數(shù)為0.69時，16個滑菇菌株被分成五大類。目前分子標(biāo)記技術(shù)在其他食用菌方面已經(jīng)廣泛運用，但在雞腿菇中報道較少。王守現(xiàn)等[13]利用SRAP技術(shù)對6個雞腿菇菌株進(jìn)行了遺傳性分析，在遺傳相似系數(shù)為0.877 0的水平，可將6個菌株分成三類。由于不同的分子標(biāo)記方法會有一定差異，因此將2種或多種分子標(biāo)記方法結(jié)合使用會有效的減少差異，使結(jié)果更加準(zhǔn)確而有說服力。

試驗利用ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)，對22株不同來源雞腿菇樣本開展試驗。使用篩選出的24條ISSR引物和24對SRAP引物，以這22株雞腿菇樣本的基因組DNA為模板，共擴(kuò)增出條帶368條，其中含有多態(tài)性條帶331條，多態(tài)性條帶占總條帶比為89.9%，說明22株雞腿菇樣本具有較為豐富的遺傳多樣性，可優(yōu)化的菌株種類多，有利于進(jìn)行雜交選育獲得優(yōu)勢品種。

經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)在相似度為0.80水平上，可將22株供試雞腿菇菌株分為四大類，表明22株供試雞腿菇菌株間具有較大的遺傳差異。其中JZB2108023與JZB2108025雖然均采集于北京海淀區(qū)鳳凰嶺，但是2種菌株并不屬于一類；JZB2108017號與JZB2108023遺傳相似系數(shù)為0.149 7親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，二者分別來自北京大興區(qū)和海淀區(qū)鳳凰嶺，由此可以說明北京地區(qū)尤其是鳳凰嶺具有較豐富的生物多樣性。JZB2018025與JZB2018030兩個菌株分別來自北京鳳凰嶺、新疆和田，2株菌株生長的地理位置及氣候條件相差甚大，但是經(jīng)聚類分析，兩者在同一分支，親緣關(guān)系接近，說明雞腿菇有異地引種，相互交流菌株的情況出現(xiàn)。綜上，本研究明確了22株雞腿菇的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為雞腿菇的種質(zhì)資源鑒定和分子育種提供了理論依據(jù)。