張玲娜 甘梅富 周夢雅 翁壽向 李玉晶 蔣菲

胃癌是常見的消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率均較高，目前手術根治是主要治療胃癌的方法。早期胃癌患者術后生存率較高，但如果確診時已處于晚期，即使經(jīng)過合理的綜合治療，5年生存率也往往不太理想。胃癌影響因素眾多，不同胃癌患者的預后差異很大，病理形態(tài)學在預測預后和指導治療方面存在一定局限性，因此尋找具有預測意義的標志物有助于評價不同時期胃癌患者的預后。Karyopherin alpha 2（KPNA2）基因位于染色體17q23-q24，其編碼產(chǎn)物是一種含529個氨基酸的核轉運受體蛋白。近來有多項研究表明，KPNA2與腫瘤形成與發(fā)展相關（特別是細胞核內KPNA2水平），在多種組織來源的腫瘤細胞（乳腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、食管鱗癌等）中呈高表達，與腫瘤的分級、分期等呈正相關[1-2]。目前關于KPNA2表達與胃癌相關性的研究報道仍較少，筆者通過檢測KPNA2在胃癌組織中的表達情況，探究KPNA2水平與胃癌各臨床病理參數(shù)及預后的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2010年1月至2014年11月在浙江省臺州醫(yī)院胃腸外科手術并具有完整臨床資料和隨訪資料的103例原發(fā)胃腺癌患者，男74例（71.8%），女29例（28.2%），年齡39～89歲（中位62歲）。隨訪至2018年12月。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制備 對所有患者的HE染色切片重新閱片。選取1個腫瘤組織區(qū)域，1個癌旁組織區(qū)域，1個正常組織區(qū)域（距離腫瘤＞5 cm的切緣部位），對照石蠟標本標記，用穿刺針（孔徑1 mm）穿入，采集組織置于蠟塊矩陣中，將其排列整齊后進行包埋；少部分高分化組織腫瘤區(qū)域太小，無法制成芯片，直接選用原蠟塊。

1.2.2 免疫組化（Envision法） 組織芯片或原蠟塊切片3 μm，常規(guī)脫蠟，3% H2O2處理后進行EDTA抗原修復，分別滴加一抗 KPNA2（1∶200稀釋，美國 Santa Cruz公司，1 ml）和p53（福州生物科技有限公司，即用型6 ml）室溫孵育2 h，其他按照說明書操作，由2位有經(jīng)驗的病理科主治醫(yī)師在顯微鏡下觀察。KPNA2判讀標準[3]：在＞10%的上皮細胞中觀察到完全核染色判為陽性；≤10%的上皮細胞核陽性或者僅細胞質陽性、不著色判為陰性。p53判讀標準[4]：腫瘤區(qū)域核染色陽性細胞比例≤10%為陰性，＞10%為陽性。

1.2.3 KPNA2與p53 mRNA水平的相關性分析 使用可視化TCGA在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）分析胃癌組織中KPNA2與p53 mRNA水平的相關性，P＜0.05為存在相關性，相關系數(shù)r＞0為正相關，反之為負相關；r絕對值越大，相關性越強。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS Statistics 22統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。KPNA2表達與患者生存之間的關系采用Kaplan-Meier生存曲線分析及l(fā)og-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KPNA2在胃癌、癌旁與正常組織中的表達 免疫組化結果顯示，KPNA2在胃組織中主要表達于細胞質和細胞核（圖1，見插頁）。胃癌組織中KPNA2核陰性54例（52.4%），陽性49例（47.6%）；癌旁組織核陽性10例（9.7%）；正常組織核陽性8例（7.8%）。胃癌組織與癌旁組織、正常組織KPNA2陽性例數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而癌旁組織與正常組織比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 免疫組化檢測KPNA2在胃組織中的表達（a：KPNA2在胃正常上皮細胞核中陰性表達；b：KPNA2在癌旁細胞核陰性表達；c：KPNA2在胃癌組織中核陽性表達；DAB染色，×20）

2.2 KPNA2表達水平與胃癌各臨床病理參數(shù)的關系 103例胃癌患者中，腫瘤直徑0.6～10.3 cm（中位4 cm）；組織學分級、組織學分類、神經(jīng)侵犯、脈管內癌栓、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期等情況見表1。將KPNA2免疫組化結果與各臨床病理參數(shù)及p53表達水平進行分析，結果顯示KPNA2表達與患者年齡、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、脈管內癌栓、腫瘤的浸潤深度、淋巴結有無遠處轉移、TNM分期、p53表達等均相關（均P＜0.05），與患者性別、組織學分級、組織學分類、淋巴結有無轉移、切緣情況、Lauren分型等均無關（均P＞0.05）。另外，在GEPIA2平臺分析了胃癌組織中KPNA2與p53 mRNA表達水平的相關性，結果顯示兩者呈正相關（r=0.24，P＜0.05）（圖 2）。

圖2 胃癌組織中KPNA2與p53 mRNA表達水平的散點圖

表1 KPNA2蛋白表達與臨床病理參數(shù)相關性分析（例）

2.3 KPNA2表達與胃癌患者生存的關系 隨訪時間0～90個月，中位時間27.5個月，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，KPNA2核陽性表達患者的生存時間為（56.7±5.8）個月，陰性表達患者為（72.8±4.5）個月，log-rank 檢驗分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.631，P=0.018），見圖 3。

圖3 KPNA2不同表達情況患者的生存曲線

3 討論

KPNA2是importin α家族的成員，通過識別和結合靶蛋白質的核定位信號，而后與其他相關蛋白質結合形成核轉運復合體，實現(xiàn)靶蛋白質的核轉位。KPNA2的中心疏水結構域有兩個核定位信號結合位點，能與具有核定位信號的入核蛋白結合；N端同時還有一個功能域結合importin β。Importin β將KPNA2和入核蛋白組成的復合物帶入細胞核，并在核內與Ran-GTP結合從而釋放KPNA2。KPNA2與Ran-GTP、CAS蛋白結合返回胞質區(qū)[1]。近來有較多研究表明，KPNA2特別是細胞核內KPNA2水平與細胞增殖、遷移及腫瘤形成發(fā)展相關，與腫瘤的分級、分期、脈管浸潤以及與預后不良相關[5-6]。

關于KPNA2促進腫瘤進展，影響預后的機制，在不同腫瘤里面可能不盡相同：乳腺癌中KPNA2可通過雌激素/c-Myc/miR-26b途徑介導雌激素刺激的細胞生長；非小細胞肺癌中KPNA2高表達誘導E2F1和OCT4入核引發(fā)腫瘤[7]；上皮性卵巢癌可能上調或促進C-Myc、p-Akt、GSK-3β 等，下調 FOXO3a、p21Cip1 和 p27kip1等，從而促進腫瘤的遷移、侵襲及上皮間質轉化[8]；肝細胞中KPNA2受miR-139負向調節(jié)，p53可抑制肝癌中的CAS和KPNA2以抑制腫瘤細胞的生長，KPNA2介導轉錄因子PLAG1向細胞核轉運[1，9]；大腸癌中Wip1與KPNA2相互作用，調節(jié)AKT/GSK-3β信號轉導和腫瘤轉移相關因子的激活[10]；食管鱗癌中KPNA2高表達誘導E2F1入核，促進細胞增殖[11]；胃癌中報道有通過KPNA2/NBS1/Snail激活Wnt/β-catenin信號，另外受miR-26b的調節(jié)也可促進細胞遷移和侵襲[1，12-13]。另外，關于p53與KPNA2，有報道稱腸癌中p53激活劑和Wip1抑制劑可下調KPNA2表達[10]；膀胱癌細胞株中敲低KPNA2之后，p53表達量上升[14]；口腔鱗癌中KPNA2可調節(jié)p53入核[15]。關于胃癌中KPNA2與p53的關系還未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織細胞核中KPNA2陽性率高，KPNA2表達與患者年齡、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、脈管內癌栓、腫瘤的浸潤深度、TNM分期等均相關（均P＜0.05），KPNA2核陽性表達患者的生存時間不及陰性表達患者。同時還發(fā)現(xiàn)KPNA2與p53在蛋白水平和mRNA水平上均有相關性（均P＜0.05），表示KPNA2促進胃癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，p53可能也扮演了重要的角色。值得注意的是，由于野生型p53蛋白不穩(wěn)定，室溫保存以及后續(xù)操作過程中往往會降解掉，因此免疫組化檢測到的陽性往往是發(fā)生突變的p53；而mRNA水平檢測是基于新鮮組織的，可同時包括突變和野生型的p53，兩者可能會有一定的差異。目前，本課題組關于KPNA2與p53在胃癌發(fā)展機制中的相關研究還在進行中。

總之，本研究表明KPNA2核表達與一些胃癌臨床病理參數(shù)及預后較差相關，與p53表達相關，提示KPNA2可能是胃癌患者的預后分子標志物以及潛在的治療靶標。