林明星 余見棟 吳志遠(yuǎn)

1.浙江省平陽縣畜牧獸醫(yī)管理中心，浙江平陽325400；2.浙江省平陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 浙江平陽325400

鴿新城疫又稱鴿瘟或鴿Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus I，PPMV-I）病，是一種由禽I 型副黏病毒引起的、流行于鴿群的高度接觸性急性傳染病，且普遍存在于各種鴿群（肉鴿、信鴿和賽鴿）中[1]。該病主要以腸炎、嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高，常給鴿場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于鴿屬珍稀家禽，市場(chǎng)對(duì)鴿專用的鴿副黏病毒疫苗需求量較少，同時(shí)根據(jù)鴿I 型副黏病毒與雞新城疫病毒同為副黏病毒，有相似的免疫原性，據(jù)楊秀環(huán)等[2]報(bào)道，用雞的新城疫弱毒疫苗和滅活疫苗對(duì)鴿進(jìn)行免疫，可有效預(yù)防和控制鴿新城疫的感染和傳播。生產(chǎn)上常借用雞新城疫疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。禽流感是由A 型流感病毒（Avianin-fluenzavirus，AIV）引起的一種以禽類感染為主的傳染性疾病[3]，根據(jù)其不同的致病性可分為低致病性禽流感和高致病性禽流感。在我國(guó)，低致病性禽流感以H9亞型為主，具有流行范圍廣、傳播能力強(qiáng)、感染發(fā)病率高等特點(diǎn)。據(jù)相關(guān)資料顯示，H9 亞型禽流感可引發(fā)禽類呼吸道感染、產(chǎn)蛋量等生產(chǎn)性能下降，繼發(fā)其他疫病，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致急性全身致死性疾病[4]。禽流感不僅感染多種家禽及鳥類，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，還可以跨越種屬屏障直接感染人[5]，具有重要的經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生意義。大量研究[6]和實(shí)踐證明，應(yīng)用疫苗的免疫接種可有效預(yù)防和控制這2 種疾病的發(fā)生與流行，但鴿體對(duì)這些疫苗免疫應(yīng)答的系統(tǒng)研究報(bào)道較少。為探討雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗對(duì)鴿的免疫效果，對(duì)比不同免疫程序下的抗體消漲情況，筆者開展了疫苗不同免疫程序?qū)澝庖咝Ч囼?yàn)，免疫后定期檢測(cè)其血清抗體的效價(jià)，了解血清抗體消長(zhǎng)規(guī)律及其相互關(guān)系，以期為制定科學(xué)的免疫程序提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)鴿為60日齡后備鴿，未進(jìn)行新城疫苗免疫、臨床健康的美國(guó)白羽王鴿高代雜交種，共24 對(duì)（48 只）。

2）試驗(yàn)疫苗。雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗，購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司。

3）主要試劑。血凝抑制試驗(yàn)用雞新城疫、禽流感（H9 亞型）病毒抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司、哈爾濱獸醫(yī)研究所，經(jīng)HA試驗(yàn)檢測(cè)效價(jià)后，配成4 個(gè)血凝單位抗原備用；紅細(xì)胞懸液按常規(guī)方法制備，用PBS 配成1%雞紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆?；阿氏液、磷酸鹽緩沖液（PBS），按相關(guān)方法自行配制，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4）儀器設(shè)備。96 孔V 型微量板、微量移液器（配滴頭）、微型震蕩器、溫箱等。

1.2 方 法

1）分組及免疫。后備鴿采血檢測(cè)其新城疫和禽流感原有抗體水平后，將整個(gè)試驗(yàn)鴿群分成A、B組，每組24 只，每對(duì)1 籠，常規(guī)飼養(yǎng)。A 組采用雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗0.4 mL肌注免疫，隔21 d 加強(qiáng)免疫1 次；B 組采用雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗0.4 mL 肌注免疫1 次。

2）樣品收集。2 組試驗(yàn)鴿于免疫后第1 周、第3周、第5 周、第7 周、第9 周、第11 周、第13 周、第17 周、第21 周、第25 周分別進(jìn)行翅下靜脈采血，每組抽取10 羽，每羽采血1 mL，血液樣品于室溫放置30 min 后，再置4 ℃冰箱中30 min，室溫下4 000 r/min 離心5 min，收集上清液于一新EP 管中。

3）檢測(cè)方法。嚴(yán)格按照《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術(shù)》《GB/T 18936-2003 禽流感診斷技術(shù)》規(guī)范采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）檢測(cè)。每次檢測(cè)的抗體滴度以log2 值表示，得出不同時(shí)段抗體水平的平均滴度。

4）結(jié)果判定。新城疫、禽流感HI 抗體滴度≥5log2 判定為免疫合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 新城疫

以不同的免疫方式接種雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗后抗體消長(zhǎng)情況見表1，后備鴿產(chǎn)生的新城疫抗體滴度從2log2～9log2 不等。

表1 各試驗(yàn)組新城疫抗體檢測(cè)結(jié)果（log2）

在免疫前及免疫后第1 周、第3 周、第5 周、第7 周、第9 周、第11 周、第13 周、第17 周、第21 周、第25 周分別采血進(jìn)行新城疫HI 抗體滴度測(cè)定。A組相應(yīng)的HI 抗體滴度平均值為0.13log2、4.83log2、7.50log2、8.42log2、8.75log2、7.67log2、7.25log2、6.78log2、6.27log2、6.09log2、5.73log2，其中抗體合格率在第1 周達(dá)75%，第3 周開始均為100%，結(jié)果顯示A 組試驗(yàn)后備鴿在免疫1 周后，新城疫抗體水平顯著上升，經(jīng)二次免疫后抗體滴度在第7 周達(dá)峰值8.75log2 后逐漸下降，至第25 周抗體滴度平均值為5.73log2，抗體合格率為100%，免疫保護(hù)期可達(dá)180 d以上，且均勻度佳。B 組相應(yīng)的HI 抗體滴度平均值為0.17log2、4.22log2、6.67log2、6.36log2、6.83log2、5.42log2、5.27log2、4.43log2、3.92log2、3.80log2、3.40log2，其中抗體合格率分別為56%、100%、91%、100%、83%、73%、52%、42%、30%、20%，結(jié)果顯示B組試驗(yàn)后備鴿在免疫1 周后，新城疫抗體水平顯著上升，在第3～7 周曲折達(dá)峰值6.83log2 后逐漸下降，至第13 周抗體滴度平均值降至免疫合格線（5log2）以下，同時(shí)抗體合格率小于70%，免疫抗體保護(hù)期約90 d。

2.2 禽流感

以不同的免疫方式接種雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗后抗體消長(zhǎng)情況見表2，后備鴿產(chǎn)生的禽流感HI 抗體水平從2log2～10log2 不等。

表2 各試驗(yàn)組禽流感（H9）抗體檢測(cè)結(jié)果（log2）

在免疫前及免疫后第1 周、第3 周、第5 周、第7 周、第9 周、第13 周、第17 周、第21 周、第25 周分別采血進(jìn)行禽流感HI 抗體滴度測(cè)定。A 組相應(yīng)的HI 抗體滴度平均值為3.50log2、7.42log2、9.25log2、9.83log2、9.58log2、9.08log2、8.09log2、8.09log2、8.00log2、7.91log2，其中抗體合格率維持在92%以上水平。結(jié)果顯示A 組試驗(yàn)后備鴿在免疫1周后，禽流感的抗體水平顯著上升，經(jīng)二次免疫后抗體水平在第5 周達(dá)峰值9.83log2 后逐漸下降，至25 周抗體滴度平均值為7.91log2，抗體合格率為100%，免疫保護(hù)期可達(dá)180 d 以上，且均勻度佳。B組結(jié)果相應(yīng)的HI 抗體滴度平均值為3.57log2、6.60log2、8.58log2、8.18log2、7.00log2、6.00log2、5.61log2、5.91log2、5.70log2、5.70log2，其中抗體合格率分別為90%、100%、100%、100%、83%、83%、82%、80%、80%。結(jié)果顯示B 組試驗(yàn)后備鴿在免疫1周后，禽流感的抗體水平顯著上升，在第3 周達(dá)峰值8.58log2 后逐漸下降，至第13 周降至6log2 以下。

3 討 論

本研究使用雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳滅活疫苗對(duì)后備鴿群進(jìn)行免疫試驗(yàn)，免疫后7 d產(chǎn)生抗體，單次免疫B 組新城疫、禽流感抗體在免疫后第3～7 周達(dá)峰值分別為6.83log2、8.58log2，抗體合格率為100%；A 組21 d 加強(qiáng)免疫后激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更高抗體水平，新城疫、禽流感抗體分別在免疫后第7 周和第5 周達(dá)峰值8.75log2、9.83log2，抗體合格率為100%。通過分析免疫抗體水平可知，在試驗(yàn)中不同免疫程序下鴿體對(duì)二聯(lián)油乳滅活疫苗具有良好的免疫反應(yīng)，二聯(lián)油乳滅活疫苗能誘導(dǎo)出較高的新城疫和禽流感免疫抗體，表現(xiàn)出良好的抗原性和免疫效果，這與丁衛(wèi)星等[7]研究結(jié)果相符。鴿型副黏病毒病與雞新城疫病同為副黏病毒，有相似的免疫原性，可交叉免疫。有研究[8]顯示，使用雞新城疫活疫苗免疫鴿易因種間差異、個(gè)體、日齡和疫苗毒力等造成免疫不穩(wěn)定。針對(duì)種鴿存欄期長(zhǎng)、雛鴿自然孵化需哺喂、同舍乳鴿日齡差異大、乳鴿母源抗體參差不齊等現(xiàn)狀，同時(shí)乳鴿免疫接種活疫苗其免疫效果易受母源抗體影響，而應(yīng)用滅活疫苗影響較小。同時(shí)鴿場(chǎng)一旦使用弱毒疫苗，易發(fā)生病毒擴(kuò)散，導(dǎo)致鴿場(chǎng)疾病遷延不斷。根據(jù)本試驗(yàn)對(duì)鴿場(chǎng)使用滅活疫苗的免疫效果監(jiān)測(cè)分析表明，滅活疫苗免疫后，抗體效價(jià)高、合格率高、整齊度好、免疫保護(hù)期長(zhǎng)，試驗(yàn)中運(yùn)用的雞新城疫、禽流感二聯(lián)油乳滅活疫苗為成熟的滅活疫苗[9]，對(duì)鴿安全穩(wěn)定，具有無病毒擴(kuò)散、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，有利于鴿場(chǎng)新城疫疫病的凈化，適于養(yǎng)鴿場(chǎng)推廣應(yīng)用。

單達(dá)聰?shù)萚10]研究報(bào)道，抗體效價(jià)上升的速度受免疫間隔時(shí)間的影響，免疫間隔14 d 的抗體水平明顯高于免疫間隔7 d，其原因可能是免疫間隔時(shí)間過短時(shí)，鴿體完成初次免疫識(shí)別與應(yīng)答等一系列生理生化反應(yīng)的時(shí)間不足，導(dǎo)致二次免疫應(yīng)答機(jī)制受阻，甚至導(dǎo)致免疫抑制。本試驗(yàn)中A 組二次免疫間隔時(shí)間為21 d，取得了較好的免疫效果。據(jù)楊秀環(huán)等[2]報(bào)道，使用雞新城疫活疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫乳鴿及成鴿，乳鴿、成鴿針對(duì)雞源和鴿源新城疫強(qiáng)毒分別攻毒后抗體保護(hù)臨界值為5log2 和4log2；白軍等[11]、李新生等[12]研究發(fā)現(xiàn)，使用雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)油乳劑滅活疫苗免疫的SPF 雞，當(dāng)新城疫HI 抗體效價(jià)達(dá)到4log2 時(shí)，攻毒保護(hù)率為80%以上，當(dāng)抗體水平≥5log2 時(shí)，攻毒保護(hù)率為100%；當(dāng)禽流感HI 抗體效價(jià)達(dá)到5log2 時(shí)，攻毒保護(hù)率為80%以上，當(dāng)抗體水平≥6log2 時(shí)，攻毒后保護(hù)率為100%，本試驗(yàn)中以抗體效價(jià)≥5log2判定為免疫合格。通過2 組不同免疫程序下后備鴿新城疫、禽流感的免疫抗體跟蹤監(jiān)測(cè)，A 組首免后7 d產(chǎn)生抗體，21 d 加強(qiáng)免疫后激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更高抗體水平，新城疫抗體在免疫后第7 周達(dá)峰值后逐漸下降，至免疫后25 周在5log2 以上；禽流感在免疫后第5 周達(dá)峰值后逐漸下降，至免疫后25 周在7log2以上，抗體合格率均達(dá)100%。B 組經(jīng)一次免疫，免疫后7 d 產(chǎn)生抗體，新城疫抗體在免疫后第3～7 周曲折達(dá)峰值后逐漸下降，至第13 周降至5log2 以下，抗體合格率僅為52%；禽流感在免疫后第3 周達(dá)峰值后逐漸下降，至第13 周降至6log2 以下，抗體合格率僅為80%。從結(jié)果中可以看出，A 組首免后隔21 d 進(jìn)行二免的鴿群，新城疫與禽流感抗體水平和整齊度均顯著高于只進(jìn)行一次免疫的B 組鴿群，免疫后6 個(gè)月仍可維持高抗體水平，可有效抵抗新城疫和禽流感的感染；只進(jìn)行單次免疫的B組，新城疫抗體保護(hù)期僅維持了90 d，禽流感抗體也在免疫90 d 后降至6log2 以下。在實(shí)驗(yàn)室條件下，HI 抗體滴度在5log2 時(shí)攻毒保護(hù)率為80%以上，并不能100%抵御病毒的攻擊，同時(shí)考慮到現(xiàn)在復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境和禽群個(gè)體的差異，建議在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)盡量保持更高的HI 抗體滴度，以確保能夠完全抵御強(qiáng)毒的攻擊。據(jù)此建議鴿場(chǎng)在實(shí)際生產(chǎn)中首次免疫至少進(jìn)行2 次以上的疫苗免疫。本試驗(yàn)為新城疫、禽流感疫苗在實(shí)際應(yīng)用過程中選擇與運(yùn)用提供了試驗(yàn)依據(jù)，為更加有效預(yù)防新城疫和禽流感奠定了基礎(chǔ)。