易飛，劉蕾，張軍

1 成都市第三人民醫(yī)院藥學部，成都 610031；2 成都市第三人民醫(yī)院實驗醫(yī)學部；3 成都市第三人民醫(yī)院腫瘤二科

鴉膽子為枯木科鴉膽子屬灌木或小喬木的干燥成熟果實，鴉膽子油乳是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳［1］。作為目前臨床常用的中藥抗癌藥物之一，鴉膽子油乳多用于肺癌、肺癌腦轉移及消化道惡性腫瘤的治療［2］。王權等［3］在鴉膽子油乳聯(lián)合含鉑類一線化療方案治療非小細胞肺癌的Meta 分析中發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳聯(lián)合含鉑類化療能提高非小細胞肺癌的腫瘤控制率，提高患者的化療效果。目前關于鴉膽子油乳可提高鉑類化療藥物臨床療效的觀察研究較多，但該藥是否與鉑類藥物有協(xié)同作用的基礎研究較少。2022年1月—12月，本課題組在肺癌A549細胞株中觀察了鴉膽子油乳與順鉑的協(xié)同抗腫瘤效應，探討鴉膽子油乳是否對肺癌A549 細胞順鉑化療具有增敏作用并分析其可能機制，以期為臨床肺癌化療的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺癌A549 細胞株（中科院典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫）。注射用順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司），鴉膽子油乳注射劑（沈陽藥大藥業(yè)責任有限公司）。RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國HyClone 公司），CCK-8 試劑盒、活性氧檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（北京Biosharp 公司），熒光雙染凋亡試劑盒（蘇州四正柏生物科技有限公司）。酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Perkin Elmer 公司）、流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）、熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 細胞的藥物敏感性觀察 人肺癌細胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，制備成單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 100 μL，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后分別加入100 μL以培養(yǎng)液稀釋的藥物。鴉膽子油乳設5個梯度濃度（625、313、156、78、39 μg/mL），順鉑亦設置5個梯度濃度（5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/mL）［4-5］，每個藥物濃度設置3 個復孔，同時設置不接種細胞的空白對照孔及不加藥物的對照孔。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTT，酶標儀檢測570 nm 處各孔光密度（OD）值，取各復孔OD 值的平均值計算各濃度藥物對細胞生長的抑制率。抑制率=（對照孔OD值-實驗孔OD 值）/對照孔OD 值×100%，根據(jù)抑制率計算藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。IC50越低，說明細胞對藥物越敏感。MTT 試驗結果顯示，鴉膽子油乳及順鉑的IC50分別為（58.47 ± 6.87）、（1.98 ± 0.31）μg/mL。根據(jù)兩種藥物的IC50，進一步采用MTT 法觀察不同濃度鴉膽子油乳對順鉑IC50的影響。分別將2.44、9.77、78.12 μg/mL的鴉膽子油乳加入2.50、1.25、0.62、0.31、0.16 μg/mL 的順鉑中，MTT 法檢測各濃度藥物對細胞生長的抑制率，計算順鉑的IC50。

1.3 細胞分組及處理 取對數(shù)生長期A549 細胞，常規(guī)胰酶消化成單個細胞懸液，以1 × 104/孔接種于6 孔板，于培養(yǎng)箱內孵育過夜。細胞貼壁后，將細胞分為對照組、鴉膽子油乳組、順鉑組及鴉膽子油乳+順鉑組，根據(jù)“1.2”中得到的鴉膽子油乳及順鉑IC50的1/2 確定藥物處理濃度，即鴉膽子油乳組以30 μg/mL鴉膽子油乳單藥處理，順鉑組以0.75 μg/mL順鉑單藥處理，鴉膽子油乳+順鉑組以30 μg/mL 鴉膽子油乳及0.75 μg/mL順鉑聯(lián)合處理，對照組不做處理正常培養(yǎng)細胞。

1.4 細胞形態(tài)及生長情況觀察 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用70%冷乙醇固定，以1 μg/mL的碘化丙啶（PI）染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。

1.5 細胞周期檢測 采用流式細胞術。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶消化收集細胞，70%冷乙醇固定細胞后，以1 μg/mL 的PI 染色液及10 μL RNase A（50×）混勻，放置于37 ℃環(huán)境下避光反應30 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期。1.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化細胞并收集，將細胞懸液加入5μL Annexin V-FITC 避光孵育5 min 后，再加入10 μL PI，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 細胞內ROS 水平檢測 采用二氯熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）熒光探針染色。取培養(yǎng)48 h 的各組細胞，在37 ℃下加載H2DCFDA 30 min，收集細胞并通過流式細胞儀在530 nm 波長處測定DCF 熒光強度，以此代表細胞內ROS水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shaprio-Wilk 法進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，重復測量資料采用重復測量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鴉膽子油乳對順鉑藥物敏感性的影響觀察結果 以0、2.44、9.77、78.12 μg/mL 鴉膽子油乳處理后的順鉑IC50分別為（1.98 ± 0.31）、（0.99 ±0.04）、（0.36 ± 0.02）、（0.10 ± 0.01）μg/mL，順鉑IC50隨著鴉膽子油乳處理濃度的增高而下降（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞形態(tài)及生長情況比較 對照組細胞生長較好，細胞數(shù)量較多且形狀為正常生長狀態(tài)；順鉑組及鴉膽子油乳組細胞數(shù)量較對照組均減少，可見少量碎片；鴉膽子油乳+順鉑組細胞生長受抑制較明顯，細胞數(shù)量最少，細胞形狀不規(guī)則且細胞碎片增多。見OSID碼圖1。

2.3 各組細胞周期比較 G0/G1期細胞比例鴉膽子油乳+順鉑組＞順鉑組、鴉膽子油乳組＞對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞周期比較（）

表1 各組細胞周期比較（）

注：與對照組G0/G1期比較，*P＜0.05；與順鉑組G0/G1期比較，#P＜0.05。

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2.4 各組細胞凋亡率比較 對照組、鴉膽子油乳組、順鉑組、鴉膽子油乳+順鉑組細胞凋亡率分別為1.12% ± 0.27%、5.03% ± 0.65%、5.48% ±0.85%、10.15% ± 1.09%，細胞凋亡率鴉膽子油乳+順鉑組＞鴉膽子油乳組、順鉑組＞對照組（P均＜0.01）。

2.5 各組細胞內ROS 水平比較 對照組、鴉膽子油乳組、順鉑組、鴉膽子油乳+順鉑組DCF 熒光強度分別為11 012 ± 6 233、17 160 ± 8 087、14 306 ±7 380、19 758 ± 9 309，細胞內ROS 水平鴉膽子油乳+順鉑組＞鴉膽子油乳組、順鉑組＞對照組（P均＜0.05）。

3 討論

我國為肺癌高發(fā)區(qū)，多數(shù)肺癌患者需要輔助化療，但目前化療藥不良反應較多，且部分患者對治療藥物產生耐藥，導致患者治療效果不佳［6］。鴉膽子油乳是肺癌常用中成藥，多項研究表明鴉膽子油乳可減少順鉑化療的不良反應，同時可提高順鉑的臨床療效［7-8］。本研究在肺癌A549 細胞株中觀察了鴉膽子油乳與順鉑的聯(lián)合抗腫瘤效應。MTT 實驗結果顯示，鴉膽子油乳可呈濃度依賴性地降低順鉑的IC50，提示鴉膽子油乳在體外可以增強A549 細胞對順鉑的敏感度。鴉膽子油乳是以鴉膽子為原料提取的脂肪油，其有效成分主要為不飽和脂肪酸類成分［9］。有研究表明，不飽和脂肪酸能降低-SH 基含量，促使細胞膜變薄，從而增加抗癌藥物向腫瘤細胞內滲入的機會，使細胞內化療藥物的濃度升高，從而產生更好的療效［10］。這可能為鴉膽子油乳可增效順鉑抗腫瘤效應的解釋之一，但其具體機制尚需進一步研究。

因為聯(lián)合用藥的目的在于降低單藥使用的濃度，減少單藥治療對正常細胞的毒性作用，并且利用藥物的協(xié)同作用增強其抗腫瘤活性，所以我們選擇1/2 IC50左右的藥物濃度聯(lián)合用藥進行后續(xù)研究。有研究顯示，鴉膽子油乳能濃度依賴性地抑制A549 細胞G0/G1期比例，從而抑制腫瘤DNA 合成［11］。順鉑為細胞周期非特異性抗癌藥物，本研究觀察了鴉膽子油乳與順鉑單用或聯(lián)用對肺癌A549細胞周期分布的影響，結果顯示鴉膽子油乳或順鉑單用時均能導致A549 細胞G0/G1期細胞比例增加，而兩藥聯(lián)用時G0/G1期細胞比例進一步增加。這提示鴉膽子油乳與順鉑單用均能導致細胞周期阻滯于G0/G1期，當兩藥聯(lián)用時，這種阻滯效果更加明顯。

多項研究表明，順鉑能夠通過增加活性氧的產生促進腫瘤細胞的凋亡［12-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳及其單體成分去氫鴉膽子苦素B可濃度依賴性的抑制肺癌細胞A549的增殖，也可濃度依賴性地增加細胞內ROS 水平，從而誘導A549 細胞凋亡［11，14］。本研究結果顯示，鴉膽子油乳或順鉑單用時均能使肺癌A549 細胞ROS 生成增加，細胞凋亡率升高；當兩者聯(lián)合應用時，細胞內ROS 水平更高，細胞凋亡率進一步增加，提示兩藥聯(lián)合應用比單一用藥誘導腫瘤細胞凋亡作用更加顯著。

綜上所述，鴉膽子油乳能夠增加肺癌A549細胞對順鉑化療的敏感性，其機制可能與阻滯腫瘤細胞于G0/G1期，增加活性氧的產生從而促進細胞凋亡有關，鴉膽子油乳可能作為一種潛在的化療增敏劑應用于臨床。本研究為體外細胞研究，而關于鴉膽子油乳是否能夠在體內增加肺癌細胞對順鉑化療的敏感性仍需要進一步的研究。