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        2017-2019年重慶市自制抗酸染色標(biāo)本室間質(zhì)量評價(jià)結(jié)果分析

        2021-06-17 02:24:10王淑玲徐蘭蘭
        關(guān)鍵詞:抗酸顯微鏡符合率

        王淑玲,顏 令,徐蘭蘭,張 震,李 甜,廖 璞

        中國科學(xué)院大學(xué)重慶醫(yī)院檢驗(yàn)科/重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/重慶市臨床檢驗(yàn)中心,重慶 400014

        由于人類免疫缺陷病毒感染、人群老年化、空氣污染等因素影響,結(jié)核病發(fā)病率逐年增高,其仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)最新發(fā)布的《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示,我國仍為全球30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一,每年新發(fā)結(jié)核病患者約90萬例,位居全球第3位[1]。及時篩選出結(jié)核帶菌人群,及時隔離及治療,減少結(jié)核病傳播已成為我國傳染病防治的重點(diǎn)。用于診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)雖然發(fā)生了變化,但直接痰涂片抗酸染色仍是診斷和監(jiān)測結(jié)核病的最具成本效益的方法[2]。痰涂片染色顯微鏡檢查錯誤可能會導(dǎo)致無法發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核病的患者,而未被檢測到的患者可能會繼續(xù)在社區(qū)中傳播疾病,或進(jìn)行不必要的治療。為了解本市各級實(shí)驗(yàn)室抗酸染色及顯微鏡檢查能力,提高本市臨床微生物抗酸染色顯微鏡檢查能力,重慶市臨床檢驗(yàn)中心于2017年下半年開始開展抗酸染色顯微鏡檢查室間質(zhì)量評價(jià)(EQA),至今開展了5次,現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)分析如下。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1菌株 膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19977(CICC10381)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

        1.1.2自制EQA標(biāo)本 在生物安全柜內(nèi)刮取血平板上生長3 d的膿腫分枝桿菌,調(diào)菌懸液到0.50麥?zhǔn)蠁挝唬?%胰蛋白酶37 ℃消化臨床膿痰30 min,分別用消化后的痰液將菌懸液稀釋10倍(4+)、50倍(3+)、100倍(2+)、200倍(1+),取10 μL不同稀釋倍數(shù)的菌懸液可制備成不同等級的樣品,涂抹玻片中央呈2 cm2菌膜,經(jīng)過穩(wěn)定性和均一性評價(jià)合格后方可作為抗酸染色EQA標(biāo)本[3-4]。

        1.2方法

        1.2.1標(biāo)本發(fā)放及檢測 EQA通過批量測試方式進(jìn)行。重慶市臨床檢驗(yàn)中心向申請參加EQA的實(shí)驗(yàn)室發(fā)送未染色的涂片標(biāo)本,由參加實(shí)驗(yàn)室人員自行染色,顯微鏡檢查讀片,然后由重慶市臨床檢驗(yàn)中心對讀片結(jié)果進(jìn)行分析評估。EQA標(biāo)本每年發(fā)放2次,每次5個標(biāo)本。本市參加EQA的實(shí)驗(yàn)室按照通知,收到標(biāo)本后立即檢測,或放置室溫保存并在規(guī)定日期前檢測和上報(bào)檢測結(jié)果。檢測時按照實(shí)驗(yàn)室臨床標(biāo)本抗酸染色及顯微鏡檢查操作規(guī)程進(jìn)行。

        1.2.2數(shù)據(jù)收集 依據(jù)CNAS-GL002:2018《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評價(jià)指南》[5],統(tǒng)計(jì)參評實(shí)驗(yàn)室對質(zhì)量評價(jià)標(biāo)本的測定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合程度。預(yù)期陰性報(bào)告陽性不得分;預(yù)期陽性報(bào)告陰性不得分;預(yù)期陽性與預(yù)期上下差1個數(shù)量級皆為符合得20分;預(yù)期陽性標(biāo)本與預(yù)期上下差2個及以上數(shù)量級得10分。參照WS/T 644-2018《臨床檢驗(yàn)室間質(zhì)量評價(jià)》,根據(jù)符合率來判斷參評實(shí)驗(yàn)室的能力是否合格(合格標(biāo)準(zhǔn)為大于等于80分)。對每一個檢測項(xiàng)目的評價(jià)為:(某項(xiàng)目測定結(jié)果可接受標(biāo)本數(shù)/某項(xiàng)目標(biāo)本總數(shù))×100=本次某項(xiàng)目測定得分,如果該項(xiàng)目得分大于等于80分則為滿意(合格);對于所有檢測項(xiàng)目的評價(jià)為:(所有項(xiàng)目測定結(jié)果可接受標(biāo)本數(shù)/標(biāo)本總數(shù))×100=本次所有項(xiàng)目測定得分,如果所有項(xiàng)目得分大于等于80分則為滿意(合格)[6]。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、率表示。

        2 結(jié) 果

        2.1參加抗酸染色顯微鏡檢查并上報(bào)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)和合格率 參加該項(xiàng)目EQA的實(shí)驗(yàn)室數(shù)從2017年58家增加至2019年88家,合格率從2017年的96.6%增加至2019年的97.7%,見表1。

        表1 2017-2019年參加并上報(bào)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室數(shù)和合格率

        2.2參加抗酸染色顯微鏡檢查實(shí)驗(yàn)室級別構(gòu)成和合格情況 參加EQA的單位主要是綜合性二、三級醫(yī)院和中醫(yī)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室,民營醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室也逐步加入。2019年綜合性二級醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室35家,占39.8%,綜合性三級醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室24家,占27.3%,系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室20家,占22.7%。參加實(shí)驗(yàn)室合格率逐步上升,見表2。

        表2 2017-2019年參加EQA實(shí)驗(yàn)室級別構(gòu)成和合格情況

        2.32017-2019年抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果 抗酸染色顯微鏡檢查各標(biāo)本符合率在88.2%~100.0%,見表3。

        表3 2017-2019年抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果

        2.4實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果符合情況 5次抗酸染色鏡檢EQA,共發(fā)放陰性標(biāo)本1 158份,陰性標(biāo)本符合率97.8%;發(fā)放陽性標(biāo)本772份,陽性標(biāo)本符合率98.1%;總體符合率97.9%,見表4。

        表4 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色鏡檢結(jié)果符合情況[n(%)]

        2.5實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查錯誤結(jié)果分析 高假陽性(HFP)即陰性標(biāo)本錯誤報(bào)告為2+~4+;高假陰性(HFN)即陽性標(biāo)本2+~4+錯誤報(bào)告為陰性;低假陽性(LFP)即陰性標(biāo)本報(bào)告為1+及以下;低假陰性(LFN)即1+及以下陽性標(biāo)本錯誤報(bào)告為陰性[7-8]。陰性標(biāo)本1 158份,回報(bào)結(jié)果HFP錯誤的占1.1%,LFP錯誤占1.1%;陽性標(biāo)本772份,回報(bào)結(jié)果HFN錯誤的占1.9%;1 930份標(biāo)本的總錯誤占2.1%,見表5。

        表5 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查錯誤結(jié)果分類[n(%)]

        2.6實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查陽性結(jié)果量化誤差(QE) 陽性級別判斷上相差2個及以上數(shù)量級,例如將4+報(bào)告為1+/2+或?qū)?+/2+報(bào)告為4+[6-7],772份陽性標(biāo)本中有42份標(biāo)本上報(bào)結(jié)果存在QE,占5.4%。

        2.7涂片抗酸染色儀器使用情況 使用全自動染片儀的實(shí)驗(yàn)室僅有3家,占3.4%,96.6%實(shí)驗(yàn)室仍是傳統(tǒng)人工染色。

        3 討 論

        WHO在2017年11月全球結(jié)核病部長級會議上重申了到2030年終止結(jié)核病流行的宣言。印度(27%)、中國(14%)和俄羅斯(9%)是全球耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最大的3個國家,我國控制結(jié)核疫情形勢相當(dāng)嚴(yán)峻,發(fā)現(xiàn)病例的創(chuàng)新方法將有助于降低結(jié)核病發(fā)病率[9]。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁內(nèi)富含的脂質(zhì)和分枝菌酸,可抵抗鹽酸酒精的脫色,苯酚復(fù)紅將其染成紅色。隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展,很多先進(jìn)的技術(shù)被應(yīng)用,如Gene Xpert MTB/RIF檢測具有準(zhǔn)確、快速、安全等優(yōu)點(diǎn),但費(fèi)用昂貴;培養(yǎng)法雖然靈敏度高,而且能鑒定到菌種和藥敏試驗(yàn),但是操作繁瑣,培養(yǎng)時間較長,報(bào)告陽性的時間可長達(dá)12周[10]。涂片抗酸染色目前仍是各級實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核分枝桿菌的基本方法。WHO宣布,控制結(jié)核病最佳策略的重要一步是通過痰涂片顯微鏡檢查來識別可疑患者,在涂片中找到結(jié)核桿菌是確診結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和各級醫(yī)院評審都對抗酸染色提出要進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和參加EQA的要求。為了加強(qiáng)標(biāo)本抗酸染色顯微鏡鏡檢的準(zhǔn)確性,促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部人員結(jié)果的一致性,重慶市臨床檢驗(yàn)中心于2017年在全國較早地開展了抗酸染色顯微鏡檢查EQA。目前抗酸染色EQA包括實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場評價(jià)、盲法復(fù)檢以及批量測試。現(xiàn)場評價(jià)的優(yōu)點(diǎn)是能直接觀察實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作,能核實(shí)并驗(yàn)證設(shè)備和耗材,因此有利于發(fā)現(xiàn)問題;缺點(diǎn)是工作時間短,工作強(qiáng)度大,而且花費(fèi)高。盲法復(fù)檢是組織者現(xiàn)場抽取實(shí)驗(yàn)室保存的陽性和陰性標(biāo)本片子送到另一個實(shí)驗(yàn)室顯微鏡檢查,這種方式可評估顯微鏡檢查結(jié)果,但不能更好地評估實(shí)驗(yàn)室染色過程。本中心自制抗酸染色涂片標(biāo)本,以批量測試方式發(fā)放到參與實(shí)驗(yàn)室,可以發(fā)現(xiàn)抗酸染色過程和顯微鏡檢查方面存在的問題。

        隨著實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)范化及質(zhì)控意識日益增強(qiáng),本市各級醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室積極參加EQA,由2017年最初的58家增加至2019年的88家實(shí)驗(yàn)室,綜合三級醫(yī)院由17家增加至24家,綜合二級醫(yī)院由21家增加至35家,中醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室由14家增加至20家,民營醫(yī)院由3家增加至6家。經(jīng)過5次EQA項(xiàng)目的開展,實(shí)驗(yàn)室總合格率從96.6%上升至97.7%,抗酸染色顯微鏡檢查正確率明顯提高,這也正是抗酸染色顯微鏡檢查EQA開展的目的體現(xiàn)。

        2017-2019年共發(fā)放涂片標(biāo)本1 930張,陽性標(biāo)本符合率為98.1%,陰性標(biāo)本符合率為97.8%,總符合率97.9%。在埃塞俄比亞南部,SHARGIE等[12]進(jìn)行了一項(xiàng)盲目復(fù)查研究,結(jié)果顯示總體錯誤為3.2%,總符合率為96.8%。本市抗酸染色鏡檢總符合率稍高于此文獻(xiàn)報(bào)道。

        201814號標(biāo)本有9家實(shí)驗(yàn)室發(fā)生了HFN結(jié)果,是符合率最低的標(biāo)本。本中心對此進(jìn)行了調(diào)查分析發(fā)現(xiàn),本次發(fā)放的5個標(biāo)本中201814號標(biāo)本制備時標(biāo)本性質(zhì)不如其他4個標(biāo)本黏稠,該標(biāo)本更容易脫色,造成有些實(shí)驗(yàn)室染色呈陰性。這提醒實(shí)驗(yàn)室抗酸染色時由于標(biāo)本性質(zhì)的不同,具體脫色時間應(yīng)根據(jù)標(biāo)本情況決定,否則易產(chǎn)生假陽性或假陰性。201913號標(biāo)本5家實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了LFP,實(shí)驗(yàn)室忽略了陰性片子的質(zhì)控。報(bào)告假陽性和假陰性結(jié)果都是重大的錯誤,本市室間質(zhì)評項(xiàng)目總錯誤率為2.1%,陰性標(biāo)本檢測回報(bào)結(jié)果假陽性率達(dá)到2.2%。MOSISSA等[13]報(bào)道不染色標(biāo)本有1.6%假陽性率,比本市實(shí)驗(yàn)室自己染色標(biāo)本假陽性低。假陽性結(jié)果會造成嚴(yán)重后果,會因誤診而對病人造成傷害,增加社會成本,并導(dǎo)致對實(shí)驗(yàn)室提供的服務(wù)失去信心。假陽性結(jié)果可能與實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員培訓(xùn)水平有關(guān),如染色技術(shù)、實(shí)驗(yàn)室人員顯微鏡檢查技術(shù)、批量測試等因素引起。假陽性結(jié)果預(yù)防措施:注意染色質(zhì)量問題,染液結(jié)晶會誤認(rèn)成抗酸桿菌;染色時玻片保持一定距離,相互徹底分開,避免菌漂移污染;染色時勿使玻片染液干燥;染色時標(biāo)本按一定順序擺放;保證染色完畢標(biāo)本標(biāo)簽完整可視。

        本市室間質(zhì)評項(xiàng)目陽性標(biāo)本檢測回報(bào)結(jié)果假陰性率為1.9%,MOSISSA等[13]研究報(bào)道假陰性率高達(dá)9.7%,AYANA等[14]研究報(bào)道假陰性率高達(dá)15.0%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本市結(jié)果。這與MOSISSA研究標(biāo)本數(shù)為32個,AYANA研究標(biāo)本數(shù)為80個,都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本市標(biāo)本數(shù)有關(guān)。假陰性結(jié)果患者可能不會接受治療,從而導(dǎo)致進(jìn)一步的社區(qū)傳播和結(jié)核病的防控失敗。通過將上報(bào)假陰性結(jié)果的標(biāo)本回收發(fā)現(xiàn),由于標(biāo)本脫色過度,造成假陰性。假陰性結(jié)果預(yù)防措施:先閱讀室內(nèi)質(zhì)控片是否在控;報(bào)告陰性前,閱片滿足300個視野。

        本市QE率高達(dá)5.4%,QE反映大家在閱片時存在一個以上數(shù)量差異,這個數(shù)據(jù)低于MOSISSA等[13]報(bào)道的不染色標(biāo)本的11.6%。造成QE原因有染色時加熱不充分,未能使抗酸桿菌充分著色;觀察涂片視野數(shù)量不足;陽性涂片的分級報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)掌握差。這需要加強(qiáng)人員培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)室間比對,逐步實(shí)現(xiàn)結(jié)果一致性。

        抗酸染色顯微鏡檢查對染色過程和顯微鏡鏡檢都有要求。目前本市實(shí)驗(yàn)室抗酸染色使用染片儀有3家,絕大多數(shù)都是人工進(jìn)行染色。針對人工染色,更需要做好室內(nèi)質(zhì)控,保證試劑的有效性和人員操作的正確性。顯微鏡鏡檢與一般檢測不同,要求人員具有豐富的形態(tài)學(xué)工作經(jīng)驗(yàn),具備一定的臨床知識和綜合分析能力。在實(shí)際工作中,由于標(biāo)本性質(zhì)、細(xì)菌本身對染液的親和力以及細(xì)菌受到藥物影響后形態(tài)的變異等,往往給實(shí)驗(yàn)室鏡檢人員對細(xì)菌的認(rèn)知帶來很大的困難,這要靠培訓(xùn)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來提高對細(xì)菌辨識能力[15]。

        EQA可發(fā)現(xiàn)和糾正常規(guī)工作中的問題。通過自制標(biāo)本開展抗酸染色顯微鏡檢查EQA工作,實(shí)驗(yàn)室對抗酸染色顯微鏡檢查質(zhì)量控制越來越重視,抗酸染色顯微鏡檢查質(zhì)量有明顯改進(jìn),推動了抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性,為臨床診療提供快速可靠的依據(jù),為結(jié)核病控制發(fā)揮積極作用。

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