■程煒軒 許國(guó)煥 張 麗 李 薇 印遇龍

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東廣州510070；2.華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070；3.廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070；4.廣東省科學(xué)院，廣東廣州510070；5.廣東碧德生物科技有限公司，廣東廣州510663；6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢430070）

尼羅羅非魚(Oreochromis nilotica)肉質(zhì)鮮美，搶食力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，已被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛引入，是聯(lián)合國(guó)推薦養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。2019年，我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)164.17萬(wàn)噸，約占世界總產(chǎn)量的40%，其出口量位列我國(guó)水產(chǎn)品前三位[1]。在集約化養(yǎng)殖過(guò)程中，尼羅羅非魚容易出現(xiàn)肝臟脂肪不正常蓄積的現(xiàn)象，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝。尼羅羅非魚患上脂肪肝，除了影響魚肉品質(zhì)外也會(huì)造成肝臟受損、免疫力降低、生長(zhǎng)遲緩以及死亡率升高等后果[2]。

對(duì)于魚類，精氨酸是必需氨基酸之一，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、尿素循環(huán)等。在魚類生長(zhǎng)、心血管、內(nèi)分泌、免疫等方面起著重要作用[3]。另外，多胺代謝途徑中的關(guān)鍵酶——鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)活性依賴于底物L(fēng)-精氨酸，在精氨酸酶作用下，該底物可轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，進(jìn)入多胺合成[4]。多胺通過(guò)調(diào)節(jié)乙酰輔酶A(acetyl-CoA)水平控制脂肪蓄積，而且在亞精胺/精胺-N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(spermidine/spermine-N1-acetyltransferase,SSAT)作用下生成精胺和亞精胺，精胺和亞精胺可通過(guò)AMP循環(huán)影響脂解和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。飼料中添加28.8～37.4 g/kg體重的精氨酸，可促使大西洋鮭肝臟中ODC的mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)促使多胺降解acetyl-CoA的限速酶SSAT以及長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化的限速酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase-1,CPT-1)的基因表達(dá)量上升，從而降低肝臟脂肪的蓄積[6]。此外，研究證明，精氨酸可以改變魚體內(nèi)不同部位的脂肪含量[7]。乙酰輔酶A羧化酶（AcetylCoAcarboxylase,ACC）催化生物體內(nèi)由乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變成丙二酰輔酶A的化學(xué)反應(yīng),制約著脂肪酸合成第一階段的速度。脂肪酸合酶（Fattyacidsynthase,FAS）催化乙酰輔酶A以及丙二酰輔酶A合成脂肪酸，是體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵酶[7]。

使用氨基酸途徑調(diào)節(jié)魚體內(nèi)脂肪蓄積，是安全且高效的方法。但是對(duì)于尼羅羅非魚，相關(guān)機(jī)制未明而且研究基礎(chǔ)尚不足以支持其應(yīng)用。本研究測(cè)定并計(jì)算尼羅羅非魚生長(zhǎng)指標(biāo)，測(cè)定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、膽汁酸(TBA)，測(cè)量肌肉脂肪含量(MFC)和肝臟脂肪含量(LFC)，檢測(cè)肝臟多胺代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量。以期探明精氨酸對(duì)尼羅羅非魚生長(zhǎng)、血脂以及多胺代謝、脂肪代謝途徑中相關(guān)基因表達(dá)等的影響，為精氨酸調(diào)節(jié)魚類脂肪代謝，以及實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用精氨酸減少魚肝臟脂肪蓄積提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚購(gòu)于廣東省羅非魚良種場(chǎng)(廣州市番禺區(qū)大穩(wěn)村)，購(gòu)回的尼羅羅非魚用基礎(chǔ)飼料定時(shí)定量投喂，馴養(yǎng)在3m×2m、水深1.5m的水泥池中。

試驗(yàn)飼料是在基礎(chǔ)飼料[8](粗蛋白含量約為36.27%，粗脂肪含量約為4.29%)中分別添加晶體精氨酸0、1.5%和2.5%，配制出三種飼料(見表1)，按照GB/T 18246—2000對(duì)飼料中氨基酸的測(cè)定方法實(shí)測(cè)3種飼料中的精氨酸含量分為2.21%、3.58%和4.46%，分別記為對(duì)照(CL)組、高精氨酸(LA)組和低精氨酸(HA)組。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：使用CL組飼料馴養(yǎng)14d以上，禁食1d，用MS-222輕微麻醉后，選取360尾健康、體格均勻、初始體重為20g左右的幼魚，隨機(jī)分配到9個(gè)圓形玻璃纖維養(yǎng)殖缸中，玻璃缸直徑1.5m，水深1m，每組3平行，每平行40尾魚，適應(yīng)1d后，待魚能正常攝食飼料且攝食量不變后開始正式試驗(yàn)，按組分別投喂CL、LA組和HA組飼料60d，每天在09:00、12:00、18:00各投喂1次，投喂量為飽食量80%，2周調(diào)整一次投喂量。飼養(yǎng)期間，水溫（30±1）℃，pH值7.0，溶解氧8.0mg/L以上，氨氮濃度小于0.2mg/L。每2d換水1次，水源為經(jīng)曝氣后的自來(lái)水，換水量為原來(lái)水量的1/4～1/3，換水的同時(shí)抽去殘餌和糞便。在正式試驗(yàn)開始后的30d以及60d時(shí)分別對(duì)每缸尼羅羅非魚隨機(jī)采樣，每次每缸各取10尾，稱重、測(cè)量魚體長(zhǎng)、尾靜脈采血，血清用于檢測(cè)生化指標(biāo)，冰盤上解剖并剝離肝臟、背部肌肉，將肝臟稱重記錄，肌肉和肝臟-80℃保存，用于檢測(cè)生化指標(biāo)或脂肪含量。30d和60d時(shí)分別從每缸再另取7尾魚冰盤上解剖取肝臟，存于液氮中用于基因指標(biāo)檢測(cè)。

表1 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平(%)

增重率(WGR，%)=[(Wt-W0)/W0]×100

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=（lnWt-lnW0）/T×100

飼料系數(shù)(FCR)=WF/(Wt-W0)

肝體比(HIS,%)=WL/Wt×100

肥滿度(g/cm3)=Wt/Lt3×100

式中：W0——試驗(yàn)開始時(shí)魚體質(zhì)量(g);

Wt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體質(zhì)量(g);

WF——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)攝食的飼料總質(zhì)量(g)；

WL——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)肝臟質(zhì)量(g)；

WN——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)內(nèi)臟質(zhì)量(g)；

Lt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體長(zhǎng)(cm)；

T——試驗(yàn)天數(shù)(d)。

血清生化指標(biāo)檢測(cè)：將采集的血液樣本在室溫下靜置30 min，轉(zhuǎn)入4℃冰箱放置3 h后4 000 r/min離心10 min，抽取上層血清，同缸魚血清合并為1份，4℃存放，用于三酰甘油(TG)、總膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、膽汁酸(TBA)的活性檢測(cè)，上述指標(biāo)檢測(cè)所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

烘干樣品后用索氏抽提法抽取脂肪后計(jì)算肝臟和肌肉脂肪含量。

基因指標(biāo)檢測(cè)：cDNA第一鏈合成與熒光定量PCR，7尾試驗(yàn)魚的肝臟用液氮速凍保存?？俁NA提取使用Trizol試劑進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程則使用TaqMan Gold RT-PCR Kit(USA)，取500 ng RNA按以下程序進(jìn)行：25℃10 min，60℃48 min，95℃5 min，得到的cDNA于-20℃保存，熒光定量PCR則使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)xLightcycler 480(Switzerland)，按以下程序測(cè)定：以β-Actin作為參照基因，使用相應(yīng)引物(見表2)，程序?yàn)?5℃5 min，然后95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s一個(gè)循環(huán)，共45個(gè)循環(huán)。完成后讀取數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)的處理按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行。

表2 RT-PCR所用引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用ΔCt法進(jìn)行目標(biāo)基因熒光定量分析；應(yīng)用SPSS 11.5軟件對(duì)獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s多重比較，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示，P＜0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸飼料對(duì)尼羅羅非魚生長(zhǎng)和內(nèi)臟指數(shù)的影響（見表3）

表3 精氨酸對(duì)尼羅羅非魚生長(zhǎng)和內(nèi)臟指數(shù)的影響

由表3可知，各組間尼羅羅非魚的末均重、增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、成活率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。肝體比和肥滿度方面，HA組顯著高于CL組、LA組（P＜0.05）。

2.2 精氨酸對(duì)尼羅羅非魚血清生化指標(biāo)的影響（見表4）

由表4可知，試驗(yàn)進(jìn)行30 d時(shí)，HA組和LA組羅非魚血清ALT、AST含量均顯著低于CL組(P＜0.05)，HA組羅非魚血清LDH顯著低于CL、LA組(P＜0.05)；經(jīng)過(guò)60 d飼喂試驗(yàn)后，HA組和LA組羅非魚血清ALT含量和AST含量顯著高于CL組(P＜0.05)；HA組的LDH含量和ALP含量顯著高于CL組、LA組(P＜0.05)；TBA方面，30 d和60 d各試驗(yàn)組與CL組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 精氨酸對(duì)尼羅羅非魚脂肪指標(biāo)的影響（見表5）

表4 精氨酸對(duì)尼羅羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

表5 精氨酸對(duì)尼羅羅非魚脂肪指標(biāo)的影響

由表5可知，30 d時(shí)，HA組和LA組尼羅羅非魚血清T-CHO、TG和LFC均顯著低于CL組（P＜0.05），而HA組和LA組尼羅羅非魚血清HDL含量則顯著高于CL組（P＜0.05）；經(jīng)過(guò)60 d飼喂試驗(yàn)后，HA組和LA組羅非魚血清T-CHO、TG、LDL、MFC含量和LFC含量顯著高于CL組（P＜0.05）；而HA組和LA組羅非魚血清HDL含量均顯著低于CL組。

圖1 試驗(yàn)30 d時(shí)精氨酸對(duì)尼羅羅非魚肝臟多胺及脂肪代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.4 精氨酸對(duì)尼羅羅非魚肝臟多胺途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響（見圖1～圖2）

由圖1可知，30 d時(shí)，HA組的尼羅羅非魚肝臟中的ODC與SSAT基因表達(dá)量顯著高于CL、LA組（P＜0.05），LA組與CL組差異不顯著（P＞0.05）。CPT-1基因表達(dá)量，LA組高于CL組，但差異不顯著（P＞0.05），各組間ACC與FAS基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 試驗(yàn)60 d時(shí)精氨酸對(duì)尼羅羅非魚肝臟多胺及脂肪代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖2可知，60 d時(shí)，HA組和LA組的尼羅羅非魚肝臟中的ODC與SSAT基因表達(dá)量顯著低于CL組（P＜0.05），而各組間CPT-1、ACC與FAS基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同精氨酸含量飼料投喂對(duì)尼羅羅非魚生長(zhǎng)及血清生化指標(biāo)的影響

與哺乳類動(dòng)物不同，精氨酸對(duì)于魚類來(lái)說(shuō)是必需氨基酸，因?yàn)轸~類缺少將谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的途徑[9]。本試驗(yàn)對(duì)尼羅羅非魚投喂不同精氨酸含量的配合飼料，各處理組尼羅羅非魚生長(zhǎng)速度無(wú)顯著性差異，這一結(jié)果與類似試驗(yàn)的研究結(jié)果相近[10]。原因是飼料中多余的精氨酸并不能提高腸道對(duì)精氨酸的吸收能力、氨基酸代謝和利用效率[11]。當(dāng)精氨酸含量達(dá)28.8 g/kg以上時(shí)，大西洋鮭（Salmo salar）也出現(xiàn)了肝體比和肥滿度顯著降低的現(xiàn)象[11]。而尼羅羅非魚則在飼料中精氨酸含量為22.1～35.8 g/kg時(shí)，肝體比和肥滿度出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，但飼料中精氨酸含量達(dá)到44.6 g/kg時(shí)，肝體比和肥滿度則上升。說(shuō)明飼料中精氨酸含量不同，可以影響?zhàn)B殖魚類肝體比和肥滿度。

血清中轉(zhuǎn)氨酶含量經(jīng)常作為生物標(biāo)記來(lái)判斷肝臟的損傷程度，脂肪肝較嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致肝細(xì)胞被破壞或細(xì)胞膜通透性增加，從而導(dǎo)致肝臟中的轉(zhuǎn)氨酶，如ALT、AST、LDH和ALP釋放到血液中[12]。從處理時(shí)間上看，投喂高精氨酸含量飼料30 d后，尼羅羅非魚血清ALT、AST含量和LDH含量顯著降低，而經(jīng)過(guò)60 d處理后，其趨勢(shì)則相反。說(shuō)明短時(shí)間使用高含量精氨酸含量飼料能保護(hù)肝臟，但是當(dāng)飼喂時(shí)間延長(zhǎng)，多余的氨基酸轉(zhuǎn)化為脂肪，對(duì)脂肪肝的生成有促進(jìn)作用，從而可能對(duì)肝細(xì)胞造成損傷或?qū)е录?xì)胞膜通透性增加[13]。

3.2 不同精氨酸含量飼料投喂對(duì)尼羅羅非魚脂肪指標(biāo)的影響

HDL主要用來(lái)運(yùn)輸或移走肝臟和血液中的膽固醇，血液中HDL和LDL總量較為穩(wěn)定，HDL含量增加往往造成LDL含量降低。另一方面，血液中膽固醇、三酰甘油含量往往與肝脂肪積累量有關(guān)[14]。經(jīng)過(guò)30 d飼喂試驗(yàn)后，HA組和LA組尼羅羅非魚血清T-CHO、TG含量和LFC含量均顯著低于CL組，而血清HDL含量則顯著高于CL組，顯示肝、血清脂肪含量有下降趨勢(shì)，而且?guī)椭沃具\(yùn)輸?shù)腍DL含量仍保持較高水平。但是經(jīng)過(guò)60 d飼喂試驗(yàn)后HA組和LA組尼羅羅非魚血清T-CHO、TG、LDL、LFC含量和MFC含量顯著高于CL組；而HA組和LA組羅非魚血清HDL含量均顯著低于CL組，顯示肝、血清脂肪含量有上升趨勢(shì)，可能與多余的氨基酸轉(zhuǎn)化為脂肪有關(guān)[13]。

3.3 用不同精氨酸含量飼料投喂對(duì)尼羅羅非魚多胺代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響

精氨酸對(duì)動(dòng)物肝臟脂肪積累調(diào)節(jié)存在兩條途徑：一氧化氮途徑和多胺途徑。多胺是生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有生物活性的低分子脂肪族含氮化合物，主要有腐胺、亞精胺和精胺，其主要功能為促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化、增加核酸的穩(wěn)定性、促進(jìn)核酸合成、參與蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)消化道黏膜的修復(fù)等[15]。在脂肪調(diào)控方面，SSAT控制亞精胺與精胺的比值[16]，對(duì)于小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1，SSAT活性與細(xì)胞脂肪蓄積量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[17]。經(jīng)過(guò)30 d飼喂試驗(yàn)后，HA組ODC表達(dá)量上調(diào)，與ODC活性依賴于底物L(fēng)-精氨酸有關(guān)[4]。SSAT表達(dá)量上調(diào)，可能與ODC表達(dá)量上調(diào)有關(guān)，導(dǎo)致精胺濃度降低[16]，從而激活SSAT活性，促進(jìn)亞精胺向精胺轉(zhuǎn)化，此過(guò)程消耗乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是脂肪酸合成的重要原料[16]。其結(jié)果是降低脂肪蓄積。

而經(jīng)過(guò)60 d高精氨酸含量飼料飼喂后，由于動(dòng)物體對(duì)精氨酸逐漸適應(yīng)，攝入多余的精氨酸反而增加底物L(fēng)-精氨酸含量，從而導(dǎo)致ODC活性下調(diào)[18]。從而促使精胺濃度降低，抑制SSAT活性，促使肝臟脂肪積累增加。

CPT-1則是線粒體中氧化長(zhǎng)鏈脂肪酸的限速酶[13]。相對(duì)的，ACC和FAS是兩個(gè)對(duì)脂肪酸合成起關(guān)鍵作用的酶。對(duì)魚類脂肪積累起著重要調(diào)節(jié)作用，隨飼料中脂肪含量的降低或升高，其表達(dá)量也相應(yīng)的升高或者降低[7]。本研究設(shè)定的精氨酸含量范圍以內(nèi)，各組ACC和FAS的表達(dá)量差異不顯著。那么，魚體肝臟、血清的脂肪蓄積，并非脂肪酸合成增加造成的。

3.4 不同精氨酸含量飼料投喂不同時(shí)間對(duì)尼羅羅非魚脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

經(jīng)過(guò)30 d不同精氨酸含量飼喂試驗(yàn)后，指示肝臟損傷的ALT、AST含量和LDH含量均顯著降低，提示脂肪積累的血清T-CHO、TG含量和LFC均顯著低于CL組，而血清HDL含量則顯著高于CL組，而且肝ODC、SSAT活性提高，反映短期飼喂高精氨酸含量飼料，可減少肝脂肪積累，對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用。而試驗(yàn)到60 d后，由于動(dòng)物體對(duì)精氨酸逐漸適應(yīng)，精氨酸對(duì)脂肪蓄積的減少作用降低，反而多余的精氨酸轉(zhuǎn)化為脂肪，導(dǎo)致指示肝臟損傷的ALT含量和AST含量顯著提高，而且HA組的LDH含量和ALP含量也顯著提高，血清T-CHO、TG、LDL、LFC含量和MFC含量也顯著提高，而指示脂肪運(yùn)輸能力的HDL含量則下降，ODC與SSAT表達(dá)量也下調(diào)，脂肪蓄積增加[19]。

在整個(gè)飼喂試驗(yàn)中，ODC與SSAT表達(dá)量先上調(diào)再下調(diào)，導(dǎo)致肝脂肪蓄積及血清生化、脂肪指標(biāo)隨之變化，顯示多胺代謝途徑在精氨酸調(diào)節(jié)尼羅羅非魚肝臟脂肪代謝過(guò)程中起重要作用，然而多胺代謝途徑影響尼羅羅非魚血脂、肝臟脂肪蓄積變化的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①30 d時(shí)，高精氨酸含量飼料飼喂可減少尼羅羅非魚肝臟脂肪蓄積、保護(hù)肝臟和減少血清脂肪含量，到60 d時(shí)，可增加尼羅羅非魚肝臟脂肪蓄積、對(duì)肝臟造成一定損傷和提高血清脂肪含量，可能與過(guò)量精氨酸轉(zhuǎn)化為脂肪有關(guān)。

②多胺代謝途徑在精氨酸調(diào)節(jié)尼羅羅非魚肝臟脂肪代謝過(guò)程中起重要作用。