■徐 茜 楊 正 朱文娟 陳思宇 肖思遠(yuǎn) 劉 晶 王紅權(quán) 蘭時(shí)樂*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

隨著養(yǎng)殖、飼料加工等行業(yè)的發(fā)展，飼料資源短缺的問題日益嚴(yán)重，蛋白飼料如魚粉等市場需求量增加，導(dǎo)致其價(jià)格不斷上漲且供應(yīng)不穩(wěn)定,開展用部分植物蛋白替代魚粉等動物蛋白飼料成為研究熱點(diǎn)[1]。豆粕粗蛋白含量高，有較均衡的營養(yǎng)成分[2]，但含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子如脲酶、植物凝集素、大豆球蛋白等在一定程度上影響幼齡動物對飼料養(yǎng)分的消化吸收和利用[3]。研究證實(shí)，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子會引起腸道組織異常，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)吸收，動物生長性能下降[4-5]。利用微生物發(fā)酵豆粕可將蛋白質(zhì)降解成多肽和游離氨基酸，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，且產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能提高免疫力，促進(jìn)生長[6-7]。李云蘭等[8]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代豆粕后保證了鯉魚腸道結(jié)構(gòu)的正常并且對生長性能沒有顯著影響。Feng等[9]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕有利于提高仔豬生長性能、飼料消化率和腸道酶活性。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕能顯著改善斷奶仔豬的生長，提高免疫功能和促進(jìn)腸道健康。Shao等[11]發(fā)現(xiàn)，用發(fā)酵豆粕替代魚粉可以提高白蝦的生長性能，且不會影響腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。

鯽魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，具有食性廣、適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，此外，鯽魚還是一種重要的觀賞性魚類[12]。隨著鯽魚消費(fèi)量的增加，其價(jià)格在一定程度上漲[13]。因此，研究鯽魚飼料中魚粉的替代品，對降低飼養(yǎng)成本、提高鯽魚的綜合養(yǎng)殖性能很有意義。本研究以鯽魚為研究對象，用發(fā)酵豆粕替代不同比例的魚粉，研究其對鯽魚生長、血清生化指標(biāo)及腸道結(jié)構(gòu)的影響，為合理開發(fā)使用大豆蛋白源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵豆粕的制備

發(fā)酵豆粕由枯草芽孢桿菌、嗜酸小球菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌發(fā)酵而成。其營養(yǎng)成分中粗蛋白41.7%、粗脂肪0.7%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼料

用發(fā)酵豆粕分別替代0、20%、40%、60%、80%的魚粉，配制成5種等氮等能的試驗(yàn)飼料（FSM0、FSM20、FSM40、FSM60、FSM80），基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。將原料充分粉碎后，按照飼料配方稱重，逐級混勻，混勻后過40目篩，制粒機(jī)制粒，曬干后包裝，置于陰涼處存放。

表1 試驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)水平（%，干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 養(yǎng)殖方法

試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地魚塘養(yǎng)殖網(wǎng)箱（1.5 m×1.5 m×1.5 m）內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)用魚為雜交鯽魚（鯉魚♂×白鯽♀）。挑選體質(zhì)健康以及規(guī)格大小相近的鯽魚（29.24±0.07）g 600尾，平均分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。試驗(yàn)前用常規(guī)飼料飼喂1周后，開始正式試驗(yàn)。日投喂量為魚體質(zhì)量的3%～5%，視天氣情況酌情調(diào)整，每天投喂2次（07:30和17:30）,試驗(yàn)周期為56 d。養(yǎng)殖期間水溫為26～30℃，pH值為7～9，溶解氧為3～5mg/L，氨氮含量小于0.05mg/L，亞硝酸鹽氮含量小于0.005mg/L。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，對各網(wǎng)箱試驗(yàn)魚稱總重、計(jì)數(shù)。從每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取9尾大小均一的魚，用MS-222麻醉后，取3尾魚作為全魚樣品用于常規(guī)營養(yǎng)成分的測定；另取6尾魚稱體重后用2mL一次性注射器從尾靜脈取血于2 mL離心管中，4℃靜置2 h后，4 000 r/min離心10 min，取上清用于血清生化指標(biāo)的測定；其中3尾魚量體長、稱取內(nèi)臟團(tuán)重、空殼重、肝臟重、腸道重、脂肪重用于生長分析；試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每個(gè)網(wǎng)箱取1尾魚的中腸、后腸1 cm放入裝有4%固定液（多聚甲醛）的10 mL離心管中，送往武漢塞維爾生物公司制作切片。

1.5 指標(biāo)測定及方法

1.5.1 營養(yǎng)成分測定

粗蛋白含量的測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432—2018[14]進(jìn)行；粗灰分含量的測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6438—2007[15]進(jìn)行；粗脂肪含量的測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6433—2006[16]進(jìn)行。

1.5.2 生長性能指標(biāo)測定

增重率（WGR,%）=100×（試驗(yàn)魚終末體重-試驗(yàn)魚初始體重）/試驗(yàn)魚初始體重

特定生長率（SGR,%/d）=100×(ln試驗(yàn)魚終末體重-ln試驗(yàn)魚初始體重)/試驗(yàn)天數(shù)

飼料系數(shù)（FCR）=飼料消耗量/（試驗(yàn)魚終末體重-試驗(yàn)魚初始體重）

日攝食率（DFI,%）=100×攝入飼料干重×2/（試驗(yàn)魚終末體重+試驗(yàn)魚初始體重）

肥滿度（CF,g/cm3）=100×體重/體長3

肝體比（HSI,%）=100×肝臟重/體重

臟體比（VSI,%）=100×內(nèi)臟重/體重

腸體比（ESI,%）=100×腸道重/體重

內(nèi)臟脂肪率（VFR,%）=100×內(nèi)臟脂肪重/體重

存活率（SR，%）=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)

1.5.3 血清生化指標(biāo)測定

采用南京建成生物工程有限公司提供的試劑盒測定血清中總膽固醇（T-CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、堿性磷酸酶(ALP)、三酰甘油（TG）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA,LSD），用Duncan’s多重檢驗(yàn)法分析，顯著水平設(shè)為P＜0.05，數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚生長的影響

2.1.1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對生長性能的影響（見表2）

表2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚生長性能的影響

由表2可知，各組的日攝食率、存活率和飼料系數(shù)無顯著差異（P＞0.05），F(xiàn)SM20、FSM40、FSM60組的飼料系數(shù)略低于FSM0組。隨著發(fā)酵豆粕替代量的增加，終末體重、增重率和特定生長率呈先升后降的趨勢，其中，F(xiàn)SM60組的終末體重、增重率和特定生長率顯著高于FSM0、FSM80組（P＜0.05），與FSM20、FSM40組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.1.2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響（見表3）

由表3可知，各組肝體比、臟體比、肥滿度均無顯著性差異（P＞0.05）；肝體比、肥滿度在FSM60組達(dá)到最高；FSM20、FSM40、FSM60組的臟體比基本無差異，但高于FSM0、FSM80組；FSM60組的腸體比顯著高于其他各組（P＜0.05），內(nèi)臟脂肪率低于其他組。

2.1.3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚全魚營養(yǎng)成分的影響（見表4）

由表4可知，隨著發(fā)酵豆粕替代量的增加，各組粗蛋白含量無顯著差異（P＞0.05），F(xiàn)SM60組的粗蛋白含量最高；各組粗脂肪含量呈先降后升的趨勢，其中FSM60組與FSM0組差異顯著（P＜0.05），與FSM20、FSM40、FSM80組無顯著差異（P＞0.05）；相較于對照組，添加發(fā)酵豆粕提高了全魚粗灰分含量。

2.2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚血清生化指標(biāo)的影響（見表5）

表3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

表4 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚全魚營養(yǎng)成分的影響（%，干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表5 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，各組的總膽固醇（T-CHO）呈先升后降的趨勢，F(xiàn)SM40組達(dá)到最高；血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)和三酰甘油（TG）以FSM60組最高；各組的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）無顯著差異（P＞0.05）；FSM80組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）顯著高于FSM0、FSM40、FSM60組（P＜0.05）；各組的堿性磷酸酶無顯著差異，但均高于FSM0組；各組的總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）無顯著差異（P＞0.05），呈先升后降的趨勢，F(xiàn)SM60組的TP含量達(dá)到最高，F(xiàn)SM40組的ALB含量達(dá)到最高。

2.3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

腸道切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1）顯微觀察發(fā)現(xiàn)，鯽魚中腸的腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，發(fā)育良好，杯狀細(xì)胞較多；隨著替代量的增加，腸絨毛寬度、肌層厚度增加，F(xiàn)SM80組的腸絨毛密度降低。后腸的腸黏膜層與腸肌層之間連接變得疏松，腸絨毛減少，肌層變厚。

由表6知，隨著發(fā)酵豆粕替代量的增加，中腸FSM60、FSM80組肌層厚度顯著高于FSM0、FSM20組（P＜0.05）；FSM40組絨毛長度顯著高于其余各組（除FSM60組）（P＜0.05）；FSM60組絨毛寬度顯著大于FSM0、FSM20組（P＜0.05），與其余兩組無顯著差異（P＞0.05）。后腸FSM60、FSM80組肌層厚度顯著大于FSM0、FSM40組（P＜0.05）；FSM40組的絨毛長度顯著高于其余各組（P＜0.05）；FSM60組絨毛寬度顯著大于其余各組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚生長的影響

本研究結(jié)果表明，隨著發(fā)酵豆粕替代量的增加，鯽魚終末體重、增重率和特定生長率呈先升后降的趨勢，與大口黑鱸魚[17]、中華鱉[18]、羅氏沼蝦[19]的研究結(jié)果一致，主要原因?yàn)榘l(fā)酵豆粕中的蛋白質(zhì)降解為易消化吸收的小分子肽類或氨基酸以及大豆球蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解，從而提高了鯽魚對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，減輕了抗?fàn)I養(yǎng)因子對生長產(chǎn)生的不良影響[20]。當(dāng)發(fā)酵豆粕添加量為60%時(shí)，鯽魚的生長性能最高，說明其對發(fā)酵豆粕的耐受性較好。

圖1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

表6 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響(μm)

臟體比、肝體比、肥滿度可以作為評價(jià)魚類營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)[21]，本試驗(yàn)中各組間的臟體比、肝體比、肥滿度差異不顯著（P＞0.05），表明發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對鯽魚的形態(tài)無明顯影響。發(fā)酵豆粕替代魚粉后，鯽魚全魚的粗蛋白含量有所提高，粗脂肪含量有所下降，這是由于微生物發(fā)酵豆粕中的小肽可以直接被腸道吸收，具有吸收速度快、載體不易飽和、耗能低等優(yōu)勢，能夠加快蛋白質(zhì)的合成[22-24]，促進(jìn)魚的生長和蛋白質(zhì)沉積；大豆肽能刺激交感神經(jīng)和產(chǎn)生熱能的褐色脂肪組織（BAT）的活性，提高甲狀腺素在血液中的濃度和基礎(chǔ)代謝水平，阻止脂肪的吸收和促進(jìn)體內(nèi)脂質(zhì)的分解[25]。FSM60組臟體比、肝體比、肥滿度、全魚粗蛋白較FSM0組高，說明60%的替代量可以改善鯽魚的營養(yǎng)狀況。馮建等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵豆粕用量的上升,粗灰分含量呈上升的趨勢，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。大多認(rèn)為，魚體粗灰分含量與礦物質(zhì)的沉積相關(guān)，大豆肽能與金屬元素(如鈣、鐵、銅、鋅等)結(jié)合生成金屬螯合物，增加了魚體對礦物質(zhì)的吸收和利用[27]，從而使粗灰分含量升高。

3.2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚血清生化指標(biāo)的影響

TG和T-CHO是反映機(jī)體脂類代謝的重要指標(biāo)[28]。本試驗(yàn)血清中TG在一定范圍內(nèi)增高，說明機(jī)體脂類代謝增強(qiáng)；膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分之一，而肝臟催化生成血清中70%～80%的膽固醇，如果血清中膽固醇含量降低，說明膽固醇在肝臟中的代謝受阻[29]。在脂類代謝能力較強(qiáng)時(shí)，TG和T-CHO含量變化趨勢往往一致[30]，本試驗(yàn)中TG和T-CHO含量呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，分別在FSM40、FSM60組達(dá)到最優(yōu)，說明隨著發(fā)酵豆粕含量的升高，鯽魚的脂代謝能力提高。

AST和ALT是動物機(jī)體參與氨基酸代謝的重要酶類，是評價(jià)肝臟健康的指標(biāo)[31]。血液中總蛋白（TP）和白蛋白(ALB)由肝臟合成，TP和ALB含量升高說明肝臟合成蛋白質(zhì)能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組的AST和ALT除FSM80組外與FSM0組無差異，且TP和ALB含量稍有上升，說明適量發(fā)酵豆粕替代魚粉對肝臟沒有損傷，并且有利于蛋白質(zhì)的合成。堿性磷酸酶(ALP)是代謝調(diào)控酶類，參與機(jī)體磷酸基團(tuán)的代謝和轉(zhuǎn)移，可使磷酸鹽等物質(zhì)沉積于魚骨中，促進(jìn)魚類骨骼生長[32]。本試驗(yàn)中ALP有上升的趨勢，說明發(fā)酵豆粕替代魚粉對骨骼生長發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。

3.3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對鯽魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

腸道是魚類吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，而腸道絨毛的主要作用是擴(kuò)大吸收面積，因此可作為水生動物腸道吸收能力的重要標(biāo)識[33]。腸道絨毛高度、絨毛密度、肌層厚度以及杯狀細(xì)胞的數(shù)量等組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)可以反映魚類腸道的發(fā)育和健康程度[34-35]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)SM60組中腸和后腸的腸絨毛長度高于對照組，絨毛寬度較對照組顯著提高。腸道絨毛長度和寬度的增加擴(kuò)大了吸收面積，說明豆粕經(jīng)發(fā)酵處理后對腸道的生長發(fā)育起了一定的促進(jìn)作用，這與李云蘭等[8]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜上所述，發(fā)酵豆粕能增加飼料中小肽等的含量，適量替代基礎(chǔ)日糧（含魚粉10%）中的魚粉能促進(jìn)鯽魚的生長，提高代謝能力，促進(jìn)腸道健康。在本試驗(yàn)條件下，綜合考慮生長、代謝和腸道吸收等因素，認(rèn)均60%的替代量為最佳。