■陳 銳 周廣平 黃 艷 馬詩(shī)淳 鄧 宇

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041)

豆粕是大豆提取豆油后的一種副產(chǎn)品，其粗蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸含量均衡[1]，是一種重要的植物性蛋白飼料來(lái)源。但豆粕含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和低聚糖等降低了豆粕的營(yíng)養(yǎng)可利用率[2-4]。酶解豆粕能有效降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。豆粕經(jīng)過(guò)酶解后，產(chǎn)生大量小肽、游離氨基酸、大豆異黃酮[6]等有益物質(zhì)，可有效改善豆粕的營(yíng)養(yǎng)性和適口性，使其不僅更易被動(dòng)物腸道吸收，還能增強(qiáng)動(dòng)物腸道的免疫能力[7]。

豆粕中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白中含有大量二硫鍵[8]，增加了酶解難度。角蛋白酶是一組具有廣泛pH和溫度范圍的蛋白酶類，它能夠降解包括羽毛、羊毛、指甲、頭發(fā)等富含二硫鍵結(jié)構(gòu)的角蛋白[9-11]。因此有研究通過(guò)在玉米-豆粕型飼料中添加角蛋白酶來(lái)降低大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量，以及提高粗蛋白、游離氨基酸在回腸中的消化率[12-14]。

嗜熱厭氧桿菌（Keratinibaculum paraultunense）KD-1是本課題組分離的一株能夠高效降解羽毛角蛋白的菌株，該菌能在24 h內(nèi)完全降解羽毛角蛋白[15]；其分泌的胞外角蛋白酶具有高活性、較寬的溫度和pH范圍，最適溫度為80℃，最適pH值為10.0[16]?；诖?，本課題組提出通過(guò)KD-1產(chǎn)生的角蛋白酶酶解豆粕，以達(dá)到降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的目的。本研究以粗蛋白、酸溶蛋白、游離氨基酸、多種抗?fàn)I養(yǎng)因子為檢測(cè)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)酶解豆粕的條件進(jìn)行優(yōu)化，以此來(lái)確定KD-1角蛋白酶酶解豆粕的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜熱厭氧桿菌（Keratinibaculum paraultunense）KD-1為中國(guó)厭氧微生物保藏中心（CCAM）保藏。

1.2 材料

雞毛購(gòu)于四川廣漢市正旺蛋白粉廠，自來(lái)水清洗后曬干備用。豆粕購(gòu)買于成都市新津縣某批發(fā)市場(chǎng)，粉碎后過(guò)1mm孔徑篩，置于干燥處儲(chǔ)存。

1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及粗酶液制備

對(duì)黃艷等[17]的培養(yǎng)基配方作進(jìn)一步優(yōu)化，將初始pH值改為8.5，羽毛濃度改為2%（W/V）。所有培養(yǎng)基和試劑均采用Hungate厭氧操作技術(shù)[18]配制，配制好后121℃滅菌30 min。將KD-1種子液接種于羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基中，55℃厭氧培養(yǎng)45 h后，取發(fā)酵液，于4℃下10 000 r/min離心15min，收集上清液，得到粗酶液。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 酶解豆粕反應(yīng)的溫度優(yōu)化

將30 g豆粕和300 mL粗酶液加入500 mL螺口試劑瓶，在65、70、75、80、85、90℃下進(jìn)行高溫酶解；以添加滅活后的粗酶液（121℃高壓蒸汽滅活30 min）作為對(duì)照組。酶解過(guò)程中定時(shí)取樣，監(jiān)測(cè)酸溶蛋白含量變化，分析酶解溫度對(duì)豆粕品質(zhì)的影響。

1.4.2 酶解豆粕反應(yīng)的底物濃度和時(shí)間優(yōu)化

分別添加10%、20%、30%、40%、50%（W/V）的豆粕在300 mL粗酶液中，以滅活后的粗酶液組為對(duì)照組，在最佳酶解溫度下，分別酶解0、1、2、3、4、5 h后取樣，監(jiān)測(cè)酸溶蛋白含量變化，分析酶解底物濃度和時(shí)間對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。

1.4.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解豆粕條件

選擇酶解溫度（80、85、90℃），底物濃度（10%、15%、20%）以及酶解時(shí)間（1、2、3 h）作為正交試驗(yàn)的因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，各因素水平依據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.4 豆粕與酶解豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子差異

最佳酶解條件下處理豆粕后，檢測(cè)豆粕和酶解豆粕中粗蛋白、酸溶蛋白、游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的差異，以及大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖、脲酶等6種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的差異。

1.5 測(cè)定方法

酸溶蛋白測(cè)定參照張雪旺[19]的方法，并略作修改，將樣品與雙縮脲試劑（雷根生物，批號(hào)：PT0003-500mL）的反應(yīng)體系縮小至2mL。使用總氨基酸（TAA）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A026）測(cè)定豆粕中游離的總氨基酸濃度。粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016第一法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子含量測(cè)定方法參照ELISA檢測(cè)試劑盒（優(yōu)選生科，批號(hào)分別為：CK-E41508M，CKE41506M，CK-E41517M）說(shuō)明書進(jìn)行。棉籽糖、水蘇糖含量使用HPLC測(cè)定。脲酶測(cè)定參照GB/T 8622—2006《飼料用大豆制品中脲酶活性的測(cè)定》[20]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 22.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行LSD多重比較檢驗(yàn)，比較組間各因素之間的差異性（P＜0.05為顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解豆粕反應(yīng)的最佳溫度優(yōu)化(見(jiàn)圖1)

試驗(yàn)結(jié)果表明溫度是影響豆粕酶解的因素之一，在酶解溫度65～85℃范圍內(nèi)，豆粕中的酸溶蛋白含量隨著溫度增加而上升；酶解溫度為85℃時(shí)，酸溶蛋白含量達(dá)到最大，為30.23%；酶解溫度為90℃時(shí)，酸溶蛋白含量略微下降了2.5%，但與85℃時(shí)的含量差異并不顯著（P＞0.05）。因此，綜合能量損耗和酸溶蛋白含量來(lái)判斷，85℃是KD-1角蛋白酶酶解豆粕的最佳溫度。

圖1 酶解溫度對(duì)豆粕酸溶蛋白含量的影響

圖2 底物濃度和酶解時(shí)間對(duì)豆粕酸溶蛋白含量的影響

2.2 酶解豆粕反應(yīng)的最佳底物濃度和時(shí)間優(yōu)化(見(jiàn)圖2)

依據(jù)不同的底物濃度（10%、20%、30%、40%、50%（W/V）將豆粕和粗酶液混合均勻后置于85℃水浴鍋中進(jìn)行高溫酶解，每間隔1 h取樣測(cè)定酸溶蛋白含量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明[圖2(A)]每克豆粕所能產(chǎn)生的酸溶蛋白含量隨著酶解底物濃度增加而降低，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時(shí)，酸蛋白含量是最高的，為25%，較之底物濃度為20%、30%、40%、50%的試驗(yàn)組分別增加了47%、108%、78%和127%，因此判斷10%的底物濃度是酶解豆粕的最佳比例。

時(shí)間對(duì)豆粕酶解的影響如圖2(B)所示，底物濃度為10%時(shí)，在前2 h內(nèi)，酸溶蛋白含量隨著時(shí)間增加而上升；酶解2 h時(shí)，酸溶蛋白含量達(dá)到最高；2 h后酸溶蛋白含量開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，酸溶蛋白的生成速率小于分解速率，因而酸溶蛋白含量呈降低趨勢(shì)。因此2 h是酶解豆粕產(chǎn)酸溶蛋白的最佳時(shí)間。

綜合以上3個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，不同酶解溫度、時(shí)間和底物濃度均能對(duì)豆粕酶解產(chǎn)生影響；KD-1角蛋白酶酶解豆粕的適宜條件為：底物濃度10%（W/V），酶解溫度85℃，酶解2 h。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳酶解豆粕條件

對(duì)酶解豆粕條件進(jìn)行正交優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。極差分析結(jié)果表明，各因素影響豆粕酶解產(chǎn)酸溶蛋白的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即底物濃度對(duì)豆粕酶解的影響最大。依據(jù)各因素水平的均值K1、K2、K3得到KD-1角蛋白酶酶解豆粕的最佳組合為B1A2C3，即是底物濃度10%，酶解溫度85℃，酶解3 h；但在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中并未有這一組合，因此重新在該條件下酶解豆粕后，測(cè)定酸溶蛋白含量。

表2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果極差分析

原料豆粕、正交試驗(yàn)中的組合9以及酶解豆粕最優(yōu)組合B1A2C3的酸溶蛋白含量分別為3.83%、26.99%、28.61%（圖3）。在最優(yōu)條件B1A2C3下，KD-1角蛋白酶酶解豆粕的酸溶蛋白含量是原料豆粕的7.5倍。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，僅底物濃度這一因素的3水平之間存在顯著差異（見(jiàn)表3），酶解溫度和酶解時(shí)間的各水平之間差異并不顯著。

圖3 原料豆粕、正交試驗(yàn)組合9、最優(yōu)組合的酸溶蛋白含量

2.4 豆粕與酶解豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子差異

表3 正交優(yōu)化試驗(yàn)酸蛋白方差分析結(jié)果

在豆粕酶解的最佳條件下，分別測(cè)定酶解豆粕和原料豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子差異。結(jié)果如表4所示，與豆粕相比，酶解豆粕的各項(xiàng)指標(biāo)與之均有顯著差異（P＜0.05）。

豆粕經(jīng)酶解后，粗蛋白質(zhì)含量提高了9.13%，酸溶蛋白、游離氨基酸含量分別是原來(lái)的7.5倍、9.7倍；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量分別下降了57.19%、59.35%、59.27%、49.38%、54.43%，經(jīng)酶解后的豆粕中沒(méi)有檢測(cè)到脲酶的存在。本試驗(yàn)結(jié)果與其他發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量下降的比例基本一致[21]。

3 討論

3.1 角蛋白酶對(duì)豆粕中酸溶蛋白含量的影響

表4 豆粕與酶解豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子差異

酸溶蛋白含量變化可以反映豆粕中大分子蛋白被水解的情況，因此在飼料生產(chǎn)中多用來(lái)作為檢測(cè)發(fā)酵豆粕小肽含量的一個(gè)指標(biāo)[22]。董偉潔等[23]利用耐酸產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌在最優(yōu)條件下固體發(fā)酵豆粕30 d后，酸溶蛋白相對(duì)含量提高了127.6%。劉延杰等[24]在pH值為9.0、50℃條件下用角蛋白酶酶解豆粕6 h后，其可溶性蛋白和酸溶蛋白含量均顯著增加，產(chǎn)生分子量＜5 000 Da的小肽占比83.71%。在本試驗(yàn)中，經(jīng)角蛋白酶酶解3 h后的豆粕，酸溶蛋白相對(duì)含量提高了647.0%，占到了粗蛋白含量的58.54%，遠(yuǎn)高于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的發(fā)酵豆粕質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 2218—2012）[25]中酸溶蛋白相對(duì)含量不得低于8%的規(guī)定。飼料中小肽含量的增加可以提高飼養(yǎng)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收利用率，促進(jìn)腸道的早期發(fā)育并提高免疫能力[7，26]。因此酶解豆粕中酸溶蛋白含量大幅度增加對(duì)提升飼料的功能和價(jià)值是有利的。

3.2 角蛋白酶對(duì)豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響

豆粕抗原蛋白中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白會(huì)對(duì)斷奶仔豬的腸道形態(tài)和免疫功能造成損害[27]；胰蛋白酶抑制因子會(huì)降低動(dòng)物腸道中多種消化酶的活性[2]；大量的寡糖也容易引起動(dòng)物的腹脹和腹瀉[28]，因此通過(guò)酶解作用來(lái)降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而促進(jìn)動(dòng)物的健康生長(zhǎng)是一個(gè)有效途徑。張忠鑫等[29]試驗(yàn)結(jié)果表明在同等酶活下，不同蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白的降解程度有較大差異。于海濤等[30]試驗(yàn)結(jié)果顯示角蛋白酶體外酶解豆粕麥麩混合物可以降低豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量。本試驗(yàn)中，經(jīng)KD-1角蛋白酶酶解后的豆粕，6種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量均顯著下降，極大地改善了豆粕的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

4 結(jié)論

①豆粕經(jīng)KD-1角蛋白酶酶解后，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著增加，抗?fàn)I養(yǎng)因子顯著下降，功能得到了改善，提高了豆粕的飼料價(jià)值。

②KD-1角蛋白酶由厭氧微生物產(chǎn)生，生產(chǎn)成本低，角蛋白酶活性高，酶作用溫度及效率均較高，生產(chǎn)過(guò)程不易污染，具有良好的應(yīng)用前景。