■柳成東 趙 平 王乙茹 王春羲 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州635001；3.昆明三正生物科技（集團(tuán)）有限公司，云南昆明650217）

2020年7月1日我國(guó)飼料與養(yǎng)殖業(yè)全面實(shí)施飼料“減抗”“禁抗”以來(lái)，飼用益生菌等有效“替抗”飼料添加劑的研究越來(lái)越受到關(guān)注（程志斌等，2017；夏濤等，2018；王乙茹等，2020）。參照飼用抗生素改善畜禽生產(chǎn)性能的主要機(jī)理——抑菌作用（柳成東等，2020），當(dāng)前各類創(chuàng)新研發(fā)的替抗飼料添加劑（包括飼用益生菌）均在積極評(píng)估其抑菌作用，以驗(yàn)證“替抗”動(dòng)物試驗(yàn)的應(yīng)用效果（夏濤等，2018；楊保和等，2018；夏濤等，2019）。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）2013年12月正式列入我國(guó)《飼料添加劑品種目錄》，近7年的科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐均表明，凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制畜禽腸道有害菌、調(diào)控腸道菌群的作用（Lee等，2018；Zhou等，2020）。然而，本課題組匯總了國(guó)內(nèi)外凝結(jié)芽孢桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)和（或）實(shí)驗(yàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的研究客觀存在“評(píng)估方法繁雜、判定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、系統(tǒng)性研究不足”等諸多問(wèn)題。文章綜述與分析了以上這些問(wèn)題，提出未來(lái)凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能研究的方向，以明確凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用及效果，為凝結(jié)芽孢桿菌在飼料及養(yǎng)殖業(yè)的替抗應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能評(píng)估的研究方法

凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的評(píng)估研究主要包括二類，體外抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估（in vitrobacteriostatic evaluation）和體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估（in vivobacteriostatic evaluation）。凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估已采用的方法包括：牛津杯法（Majeed等，2016；Fu等，2018）、最小抑菌濃度法（郭豐慶等，2020）、殺菌能力法（Pan等，2013）、平板劃線法（陳桂芳等，2018）等。體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估一般通過(guò)檢測(cè)飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的動(dòng)物腸道食糜及糞便中標(biāo)志性特定細(xì)菌的數(shù)量（腸道有害菌、腸道有益菌），來(lái)評(píng)估飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌群的調(diào)控效果，尤其是評(píng)估對(duì)腸道有害菌的抑制作用。腸道特定細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)一般采用平板計(jì)數(shù)法（Lan等，2017；Khajeh等，2020）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（趙娜等，2017；Pu等，2018）、宏基因組測(cè)序法（Wu等，2018；Li等，2019）等。

牛津杯法是體外抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用的最常用方法（姚曉紅等，2015；張韻等，2017；嚴(yán)濤等，2018；李靜舒等，2020）。然而，匯總以往的實(shí)驗(yàn)報(bào)道（見表1）發(fā)現(xiàn)，牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的存在的問(wèn)題是：以抑菌圈直徑值（diameter of inhibition zone,DIZ）來(lái)判斷抑制作用的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一（馮媛媛等，2017）。姚曉紅等（2015）用牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用，采用的抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)是：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“中敏感”（10 mm＜DIZ＜20 mm）和“低敏感”（DIZ＜10mm）。Fu等（2018）用牛津杯法同樣評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用，采用判定標(biāo)準(zhǔn)是：“高敏感”（DIZ＞12 mm）、“低敏感”（6 mm＜DIZ＜12 mm）和“不敏感”（DIZ＜6 mm）。最新的李靜舒等（2020）的研究，將牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌抑制大腸桿菌的判定標(biāo)準(zhǔn)分為4個(gè)檔次：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“中敏感”（16 mm＜DIZ＜20 mm）、“低敏感”（7.8 mm＜DIZ＜12 mm）和“不敏感”（DIZ＜7.8 mm）。以上抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)的差異造成凝結(jié)芽孢桿菌抑菌效果無(wú)法比較。

傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法能夠直接檢測(cè)腸道特定菌及屬的總數(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果直觀、可判讀性高，缺點(diǎn)是檢測(cè)效率低、數(shù)據(jù)可重復(fù)性較差（郭佳等，2020；馬培培等，2020）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法也可以直接檢測(cè)腸道特定菌，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)效率高，但缺點(diǎn)是只能檢測(cè)指示菌的相對(duì)值，尤其是無(wú)法定量腸道總菌數(shù)的數(shù)量級(jí)變化（李萌等，2018）。宏基因組測(cè)序法可高效地檢測(cè)飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物腸道大部分細(xì)菌種屬的影響，但缺點(diǎn)是只能檢測(cè)細(xì)菌豐度值，尤其是無(wú)法定量某一特定腸道菌的數(shù)量級(jí)（高航等，2020）。因此，由于檢測(cè)方法不同，評(píng)估飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌

群影響的報(bào)道有一定的差異（趙娜等，2017；Zhen等，2018）。此外，凝結(jié)芽孢桿菌添加量、添加方式、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種、試驗(yàn)日齡、采樣部位等因素也會(huì)影響飼用凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)控腸道菌群的作用效果（見表2）。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑(DIZ)(牛津杯法，mm)

表1（續(xù)）凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑(DIZ)(牛津杯法，mm)

表2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌群的調(diào)控效果（飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，腸菌數(shù)測(cè)定）

表2（續(xù)）飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌群的調(diào)控效果（飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，腸菌數(shù)測(cè)定）

2 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的評(píng)估

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有害菌的抑制作用

等，2018；李靜舒等，2020；周倩等，2020）、對(duì)沙門氏菌的DIZ值為10.2～18.6 mm（Majeed等，2016；張韻等，2017；趙麗娜，2017；金迅等，2018；周倩等，2020），說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌有一定的抑制作用。然而，唯一一篇報(bào)道顯示：凝結(jié)芽孢桿菌LU-B02對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑制作用（劉全永等，2015）。

對(duì)應(yīng)表1和表2匯總了飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)豬雞腸道主要有害菌的影響。在肉雞飼糧中添加凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌的報(bào)道顯示：與對(duì)照組（BD）相比，實(shí)驗(yàn)組（PD）雞腸道食糜大腸桿菌數(shù)量降低9.5%～100.0%（Hung等，2012；王政等，2016；趙娜等，2017；Zhen等，2018；Wu等，2018）、沙門氏菌數(shù)量下降18.5%～60.8%（Zhen等，2018）。趙娜等（2017）使用AV500肉雞，1～42日齡試驗(yàn)階段在飼糧中添加0.3×106CFU/g（全價(jià)配合飼料）凝結(jié)芽孢桿菌，檢測(cè)42日齡腸道大腸桿菌結(jié)果顯示：與BD組相比，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的PD組肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量下降100.0%。Zhen等（2018）研究1.6×106CFU/g飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)科寶肉雞腸道菌群的影響，42日齡腸道菌群檢測(cè)結(jié)果顯示：與BD組相比，PD組肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量下降65.1%。Wu等（2018）在AA肉雞飼糧中添加4.0×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，至42日齡檢測(cè)腸道大腸桿菌數(shù)量的結(jié)果也顯示PD組肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量比BD組下降了65.1%。此外，只有Zhen等（2018）報(bào)道了肉雞飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)腸道沙門氏菌數(shù)量級(jí)降低的效果，這一方面的研究及數(shù)據(jù)有待于豐富。

在仔豬飼糧中添加凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌的報(bào)道顯示：與BD組相比，PD組仔豬腸道食糜或糞便中大腸桿菌數(shù)量降低46.4%～91.7%（王向榮等，2013；黃遵錫等，2017；黃遵錫等，2020）。王向榮等（2013）使用DLY斷奶仔豬，在32～67日齡試驗(yàn)階段，在飼糧中添加0.16×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)PD組糞便中的大腸桿菌比BD組下降了30.9%。隨后，黃遵錫等（2017、2020）連續(xù)報(bào)道，飼喂0.5×107CFU/g和2.0×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌的PD組仔豬糞便、食糜中大腸桿菌比BD組分別下降了46.4%和90.8%。然而，至今沒(méi)有飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)豬腸道沙門氏菌數(shù)量級(jí)影響的試驗(yàn)報(bào)道，這一方面的研究有待補(bǔ)充。

以上分析表明：肉雞飼糧添加106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌、仔豬飼糧添加106～107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，能夠有效降低豬雞腸道有害菌大腸桿菌，且這一效果與體外牛津杯法評(píng)估結(jié)果相符。然而，對(duì)于沙門氏菌的抑制效果，有待于更多的動(dòng)物試驗(yàn)證明。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有益菌的影響

表2匯總了飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)豬雞腸道主要有益菌的影響。在肉雞飼糧中添加凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌的報(bào)道顯示：與BD組相比，PD組雞腸道食糜乳酸桿菌數(shù)量提高55.6%～1 350.0%（Hung等，2012；王政等，2016；Wu等，2018；Zhen等，2018）、雙歧桿菌數(shù)量提高4.0%～478.9%（Wu等，2018；Zhen等，2018）。Zhen等（2018）使用科寶肉雞，1～42日齡試驗(yàn)階段在日糧中添加1.6×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，檢測(cè)腸道有益菌的結(jié)果顯示：肉雞18日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高113.8%和233.3%；肉雞42日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高57.3%和8.0%。Wu等（2018）使用AA肉雞，研究4.0×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)腸道有益菌的影響，結(jié)果顯示，肉雞28日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高154.5%和478.9%；肉雞42日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高55.6%和4.0%。以上結(jié)果表明，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞前期腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌有較好的增加效應(yīng)，但隨著肉雞日齡增加及凝結(jié)芽孢桿菌的持續(xù)使用，似乎對(duì)后期肉雞腸道有益菌的增加效應(yīng)減弱，尤其是對(duì)雙歧桿菌無(wú)增加效應(yīng)。

在仔豬飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌的報(bào)道顯示，與BD組相比，PD組仔豬腸道食糜或糞便中乳酸桿菌數(shù)量提高81.8%～727.6%（王向榮等，2013；黃遵錫等，2017；黃遵錫等，2020）、雙歧桿菌提高54.5%（王向榮等，2013）。黃遵錫等（2017、2020）連續(xù)報(bào)道，飼喂高劑量0.5×107CFU/g和2.0×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌的PD組乳酸桿菌比BD組分別提高了270.8%和727.6%。王向榮等（2013）研究表明，與BD組相比，0.16×107CFU/g較低劑量的凝結(jié)芽孢桿菌使仔豬糞便乳酸桿菌數(shù)量提高81.8%。以上結(jié)果表明，仔豬飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌具有顯著增加腸道有益菌乳酸桿菌的作用，且這一作用有顯著的劑量效應(yīng)。此外，只有一篇報(bào)道顯示飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌具有增加仔豬腸道有益菌雙歧桿菌的作用（王向榮等，2013），因此這一方面的研究有待于完善。

在體外抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估方面，迄今為止沒(méi)有凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有益菌（包括乳酸桿菌、雙歧桿菌等）的研究報(bào)道，因此這一方面的研究亟待開展。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)飼料及飼料源金黃色葡萄球菌的抑制作用

表1匯總了牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用的DIZ值范圍14.4～20.7 mm（Majeed等，2016；張韻等，2017；趙麗娜，2017；金迅等，2018；周倩等，2020），說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)存在于飼料和飼料原料中有害菌金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。只有劉全永等（2015）研究報(bào)道顯示，凝結(jié)芽孢桿菌LU-B02對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)商業(yè)飼用益生菌的抑菌作用

我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)范的可以在飼料中添加的商業(yè)飼用益生菌有34種《飼料添加劑品種目錄（2013）》，其中以單一菌或復(fù)合菌在飼料及養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的包括（唐仁龍等,2018）：芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌）、乳酸菌（屎腸球菌、糞腸球菌）、酵母菌（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母）等。表1匯總了牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)主要商業(yè)飼用益生菌抑制作用的研究報(bào)道，分析顯示：①凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)主要商業(yè)飼用益生菌的體外抑菌作用評(píng)估缺乏系統(tǒng)性。目前，只有凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和植物乳桿菌的研究結(jié)果（姚曉紅等，2015；趙鈺等，2015；Fu等，2018；），對(duì)當(dāng)前“替抗”應(yīng)用較為普遍的地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌等飼用益生菌的抑制研究沒(méi)有客觀數(shù)據(jù)報(bào)道。②采用牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用有矛盾。姚曉紅等（2015）用牛津杯法評(píng)估了3株凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號(hào)B4、BFS-2、NJ）對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示3株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用。同年，趙鈺等（2015）也用牛津杯法得出凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號(hào)LL1103）對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用的結(jié)論。Fu等（2018）再次證明凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號(hào)L1208）對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用。相反，劉全永等（2015）卻報(bào)道凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號(hào)LU-B02）對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑制作用。進(jìn)一步分析，2篇飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示：飼用凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌組合飼喂仔豬的生長(zhǎng)性能低于單一凝結(jié)芽孢桿菌的飼喂效果，這一結(jié)果支持了牛津杯法評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌有頡頏效應(yīng)的觀點(diǎn)（黃遵錫等，2017；王乙茹等，2018）。

綜合以上結(jié)果，鑒于凝結(jié)芽孢桿菌與其他商業(yè)飼用益生菌之間可能存在頡頏效應(yīng)，因系統(tǒng)地開展凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)其他商業(yè)飼用益生菌的抑菌作用研究，才能科學(xué)地指導(dǎo)飼料與養(yǎng)殖企業(yè)選擇凝結(jié)芽孢桿菌和其他飼用益生菌的組合應(yīng)用。

3 展望

借鑒飼用抗生素抑菌促生長(zhǎng)的作用效果，在當(dāng)前“禁抗”的大形勢(shì)下，飼糧補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制畜禽腸道有害菌、維持腸道菌群平衡的作用，從而改善畜禽健康與生產(chǎn)性能。未來(lái)的研究應(yīng)加快凝結(jié)芽孢桿菌體內(nèi)、體外的系統(tǒng)抑菌性能評(píng)估，重點(diǎn)要補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)腸道有益菌和其他商業(yè)益生菌的可能抑制作用研究，為凝結(jié)芽孢桿菌在飼料及養(yǎng)殖業(yè)的替抗應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。