馬宇光,昝 瑛,王 夢(mèng),高 瀟,趙 芳,張淑群

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科,陜西西安 710004

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，2017年有6.2萬例左右新診斷病例[1-2]。有研究報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA1(lncRNA NNT-AS1)在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[3-5]，且lncRNA NNT-AS1可以與微小RNA-424(miR-424)結(jié)合促進(jìn)胃癌的發(fā)生和周期進(jìn)展[6]。miR-424是腫瘤相關(guān)miRNA[7]，在不同惡性腫瘤中可發(fā)揮促癌或抑癌作用[8-10]，而在子宮內(nèi)膜癌中miR-424低表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和克隆球形成[11]。本研究旨在探討lncRNA NNT-AS1和miR-424在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年2月至2014年10月在本院行手術(shù)切除的60例子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜癌新鮮組織為研究材料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者首次行手術(shù)切除；(2)切除組織經(jīng)病理專家證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌；(3)患者未經(jīng)任何形式的腫瘤治療；(4)具有完整的臨床病理和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮內(nèi)膜癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(2)合并其他器官腫瘤者；(3)合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者。子宮內(nèi)膜癌患者年齡38～76歲，平均(56.81±10.44)歲；組織病理類型為子宮內(nèi)膜樣42例，非子宮內(nèi)膜樣18例；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例；肌層浸潤(rùn)程度，<1/2肌層39例，≥1/2肌層21例；病理分級(jí)，G1 31例，G2 20例，G3 9例；脈管浸潤(rùn)28例，無脈管浸潤(rùn)32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。另選取同期因子宮其他疾病行子宮切除的40例患者的新鮮正常子宮內(nèi)膜組織作為研究材料。子宮其他疾病患者年齡40～72歲，平均(55.89±11.25)歲。2組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合赫爾本宣言，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和其家屬均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器 Trizol試劑來自北京天漠科技開發(fā)有限公司；研缽來自江蘇順和教學(xué)儀器有限公司；三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇來自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)水，lncRNA NNT-AS1、miR-424和內(nèi)參U6引物來自生工生物工程上海(股份)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自美國(guó)Fermentas公司；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)試劑盒來自美國(guó)Invitrogen公司；NanoDrop2000來自美國(guó)Thermo公司；7500 PCR儀來自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3q-PCR檢測(cè) 取手術(shù)切除的新鮮組織立即凍于液氮中，放于研缽中研為粉末后移至EP管中，在管中加入1 mL Trizol試劑裂解，加入200 μL三氯甲烷混勻后4 ℃靜置5 min，12 000 r/min離心30 min，獲取上層水相溶液與等體積的異丙醇混勻后4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄掉液體，加入無水乙醇4 ℃、12 000 r/min離心30 min，DEPC水溶解RNA，NanoDrop2000測(cè)得RNA純度(A260/A280=2.0左右)和水平。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系：含MgCl21 μL的10%DNaseⅠ反應(yīng)緩沖液1 μL，總RNA 1.0 μg，RNase自由H2O 1～9 μL，總體積為10 μL，37 ℃ 30 min將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。以cDNA為模板，按照q-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，Platinum?含有ROX的定量PCR SuperMix-UDG 25 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、熒光探針1 μL、cDNA模板5 μL、ddH2O 17 μL，總體積50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，45個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 min，60 ℃ 30 s)。7500 PCR儀上機(jī)檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算lncRNA NNT-AS1和miR-424的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：

lncRNA NNT-AS1引物F：5′-AGTTCCACCAAGTTTCTTCA-3′,R：5′-AGGTTTTGCCAGCATAGAC-3′；miR-424引物F：5′-CCAGCAGTTCAAAACATGAATTG-3′,R：5′-TATGGTTGTTCTCGACTCCTTGAC-3′；內(nèi)參U6引物F：5′-CGTTTTACTTCCTCATACAGCAC-3′,R′5′-GCA-CCAAGAGACCTGTGACA-3′。

1.4隨訪 采用電話詢問或者門診查詢的方式對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行隨訪，時(shí)間為3個(gè)月隨訪1次，計(jì)算患者手術(shù)后5年生存率。

2 結(jié) 果

2.1不同子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1和miR-424的相對(duì)表達(dá)水平比較 子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1相對(duì)表達(dá)水平(1.70±0.31)高于正常子宮內(nèi)膜組織(1.04±0.33)，而miR-424相對(duì)表達(dá)水平(0.71±0.24)則低于正常子宮內(nèi)膜組織(0.97±0.21)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1和miR-424的相對(duì)表達(dá)水平

2.2子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1、miR-424相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1相對(duì)表達(dá)水平與患者的年齡、組織病理類型、肌層浸潤(rùn)程度和病理分級(jí)無關(guān)(P>0.05)，與FIGO分期、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；子宮內(nèi)膜癌組織中miR-424相對(duì)表達(dá)水平與患者年齡、組織病理類型和病理分級(jí)無關(guān)(P>0.05)，與FIGO分期、肌層浸潤(rùn)程度、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1和miR-424相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1、miR-424相對(duì)表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響 60例子宮內(nèi)膜癌患者隨訪結(jié)果顯示，死亡34例，存活26例，5年生存率為43.33%。

根據(jù)子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1、miR-424的相對(duì)表達(dá)水平將患者分為lncRNA NNT-AS1高表達(dá)組(>1.70，26例)、lncRNA NNT-AS1低表達(dá)組(≤1.70，34例)和miR-424高表達(dá)組(>0.71，33例)和miR-424低表達(dá)組(≤0.71，27例)。lncRNA NNT-AS1高表達(dá)組死亡17例，存活9例，5年生存率為34.62%；lncRNA NNT-AS1低表達(dá)組死亡17例，存活17例，5年生存率為50.00%；miR-424高表達(dá)組死亡18例，存活15例，5年生存率為45.45%，miR-424低表達(dá)組死亡16例，存活11例，5年生存率為40.74%。見表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1、miR-424相對(duì)表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響

分別繪制lncRNA NNT-AS1和miR-424高、低表達(dá)組的Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-Rank檢驗(yàn)分析顯示，lncRNA NNT-AS1高表達(dá)組患者的預(yù)后比lncRNA NNT-AS1低表達(dá)組差(P<0.05)，而miR-424高表達(dá)組患者的預(yù)后則比miR-424低表達(dá)組好(P<0.05)。見圖2。

圖2 lncRNA NNT-AS1與miR-424高、低表達(dá)子宮內(nèi)膜癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4單因素和多因素Cox回歸分析子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的影響因素 建立COX比例回歸模型，以本研究資料為樣本，以預(yù)后狀況為應(yīng)變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。分別采用單因素和多因素COX回歸分析可能影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的影響因素，結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期為晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA NNT-AS1高表達(dá)和miR-424低表達(dá)是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 Cox回歸分析子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的影響因素

2.5子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1相對(duì)表達(dá)水平與miR-424的相關(guān)性 Pearson分析顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1相對(duì)表達(dá)水平與miR-424呈負(fù)相關(guān)(r=-0.368，P<0.05)，見圖3。

圖3 子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1相對(duì)表達(dá)水平與miR-424的相關(guān)性

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是全球女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和病死率。近年來，由于肥胖癥和代謝性疾病的發(fā)病率增加，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率和病死率呈逐年增加的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化，嚴(yán)重威脅女性患者的生命健康[12-13]。子宮內(nèi)膜癌患者早期癥狀為不規(guī)則陰道流血，容易被患者忽視，由于子宮內(nèi)膜癌具有高度侵襲性，故診斷時(shí)患者已出現(xiàn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)展為腫瘤晚期[14]。目前子宮內(nèi)膜癌患者的治療主要包括手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療，早期患者較晚期患者的療效較好，但對(duì)晚期和復(fù)發(fā)子宮內(nèi)膜癌患者的治療目前仍然是個(gè)難題[15]。分子靶向治療是新近研究的晚期腫瘤重要的新型治療手段，有研究報(bào)道，布立尼布和吉非替尼等一些分子靶向藥物對(duì)晚期子宮內(nèi)膜癌患者具有一定的療效，但是總體臨床反應(yīng)率較低[16]，因此，探尋特異性的新型治療靶點(diǎn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的治療至關(guān)重要。

人類基因組包含非編碼DNA，其產(chǎn)物非編碼RNA(ncRNA)是可以影響基因調(diào)控和腫瘤細(xì)胞惡性行為的關(guān)鍵因子，包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和miRNA。lncRNA是一組長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA，由于缺乏開放閱讀框，不能翻譯成蛋白質(zhì)，但它們可以通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來調(diào)節(jié)多種病理和生理過程[17]。lncRNA由于與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)而受到廣泛的關(guān)注，其在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和放化療耐藥等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[18]。lncRNA NNT-AS1位于帶有3個(gè)外顯子的人類染色體5p12上，是新型的腫瘤相關(guān)lncRNA。lncRNA NNT-AS1在非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌中表達(dá)增加，沉默lncRNA NNT-AS1的表達(dá)，均可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3-4]，但有文獻(xiàn)報(bào)道在胃癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達(dá)下降，并且lncRNA NNT-AS1的低表達(dá)與原發(fā)腫瘤的位置和淋巴/血管浸潤(rùn)有關(guān)[19]。由此可見，lncRNA NNT-AS1在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用，但是其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況未知。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，并與患者的FIGO分期、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。

有研究報(bào)道，miR-424在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用，甚至是相反的，在喉鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中miR-424表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和黏附，并影響細(xì)胞周期進(jìn)程[7-8]。在肝細(xì)胞癌中miR-424表達(dá)下調(diào)，并與甲胎蛋白、TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肝癌總生存期差有關(guān)，miR-424在體內(nèi)和體外均抑制細(xì)胞增殖和侵襲能力[10]。DONG等[11]報(bào)道，miR-424表達(dá)降低與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較差有關(guān)，并降低腫瘤細(xì)胞侵襲和腫瘤球形成能力。ZHENG等[20]報(bào)道，miR-424表達(dá)降低與子宮內(nèi)膜癌患者臨床腫瘤分期、細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞遷移能力有關(guān)，miR-424抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-424的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，并與患者的病理分期、肌層浸潤(rùn)程度、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。

最近研究表明，lncRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)，與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性相互作用，從而使miRNA遠(yuǎn)離其靶標(biāo)mRNA，阻止miRNA發(fā)揮調(diào)控作用[5]。CHEN等[6]報(bào)道，lncRNA NNT-AS1與miR-424結(jié)合，通過抑制其表達(dá)，在胃癌中發(fā)揮促癌基因的作用。Pearson相關(guān)分析顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1相對(duì)表達(dá)水平與miR-424呈負(fù)相關(guān)(r=-0.368,P<0.05)，表明lncRNA NNT-AS1在子宮內(nèi)膜癌中可能通過miR-424發(fā)揮作用，但具體的作用機(jī)制還有待基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。進(jìn)一步單因素和多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，病理分期晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA NNT-AS1高表達(dá)和miR-424低表達(dá)是影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，且生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1高表達(dá)和miR-424低表達(dá)的患者生存情況較差，提示二者與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA NNT-AS1呈高表達(dá)，miR-424呈低表達(dá)，二者的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，lncRNA NNT-AS1可能通過miR-424發(fā)揮作用。lncRNA NNT-AS1和miR-424是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的影響因素，lncRNA NNT-AS1/miR-424軸可能是子宮內(nèi)膜癌潛在的治療靶點(diǎn)。