趙 紅，馮芝恩，李德龍，段立莉，栗景蕊△

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院：1.檢驗科；2.口腔頜面-頭頸腫瘤科，北京 100050

早在1930年，奧托·沃伯格就證明了癌細(xì)胞即使在氧氣存在的情況下也依賴糖酵解作用，這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解，即“Warburg效應(yīng)”[1]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞具有代謝表型改變的特點。腫瘤細(xì)胞可以利用糖酵解產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生大量乳酸(LA)。有研究表明，LA對人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制率高達(dá)95%，細(xì)胞毒活性可降低50%[2]，使機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，從而為癌細(xì)胞的生長擴(kuò)散提供有利條件?？谇击[狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)是指發(fā)生于口腔內(nèi)，以鱗狀細(xì)胞為主的惡性腫瘤。癌細(xì)胞可以發(fā)生于牙齦、硬腭、舌體、頰黏膜、嘴唇等等多種器官，屬于頭頸部惡性程度最高、危害性最大的腫瘤[3]。目前，腫瘤微環(huán)境代謝變化引起的CTL的變化在口腔鱗癌中的作用研究相對較少。本文通過測定分析健康者與不同臨床分期的口腔鱗癌患者外周血LA及CD8+T細(xì)胞水平，從口腔鱗癌患者代謝水平與機(jī)體免疫功能的關(guān)系方面，探討LA及CTL在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年11月至2020年9月在本院口腔頜面-頭頸腫瘤科住院治療的口腔鱗癌患者50例為試驗組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～70歲，經(jīng)病理組織學(xué)診斷為鱗癌且未進(jìn)行放化療處置者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他腫瘤史者；(2)伴有其他系統(tǒng)性疾病者；(3)不愿意參與此項研究者。 試驗組年齡20～70歲；男26例，女24例；舌癌18例，牙齦癌11例，口底癌11例，頰癌5例，唇癌5例；TNM分期[美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第八版]Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期25例。另選擇同期在本院口腔頜面-頭頸腫瘤科住院患者的陪護(hù)家屬且身體健康者70例為對照組，年齡20～70歲，其中男36例，女34例。2組年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審查批件號：CMUSH-IRB-KJ-PJ-2018-14)，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑 白洋離心機(jī)購自北京白洋醫(yī)療器械有限公司，Sysmex XS-500i血細(xì)胞分析儀購自日本Sysmex公司，Siemens RXL-MAX生化分析儀購自德國Siemens公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。血常規(guī)檢測試劑為血細(xì)胞分析儀配套試劑，LA測定試劑為生化分析儀配套試劑。Fc受體封閉劑、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD3單克隆抗體(CD3-PerCP-Cy5.5)、異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的CD8單克隆抗體(CD8-FITC)均購自達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司，一次性含氟化鈉真空采血管和一次性EDTA抗凝真空采血管購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理 采用一次性含氟化鈉真空采血管和一次性EDTA抗凝真空采血管，每管內(nèi)采集所有研究對象空腹外周靜脈血2 mL。一次性含氟化鈉真空采血管內(nèi)外周血以2 500 r/min離心10 min，取上層血漿立即進(jìn)行LA含量測定。一次性EDTA抗凝真空采血管內(nèi)外周血顛倒混勻8次后即進(jìn)行血常規(guī)檢測，完成血常規(guī)檢測后的標(biāo)本用于流式細(xì)胞分析。

1.3.2標(biāo)本檢測 用全血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測，得出淋巴細(xì)胞計數(shù)。對分離的血漿立即用全自動生化分析儀及LA測定試劑盒檢測LA水平。從EDTA抗凝管中取100 μL新鮮靜脈血，加入Fc受體封閉劑5 μL，室溫孵育10 min后，分別加入CD3-PerCP-Cy5.5、CD8-FITC各3 μL，在室溫下避光孵育20 min，然后加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫避光裂解紅細(xì)胞15 min，350×g離心5 min，棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL離心洗去血紅蛋白，并重新懸浮于300 μL PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測2組CD3+和CD8+雙陽性T細(xì)胞的百分比。根據(jù)淋巴細(xì)胞計數(shù)及CD3+和CD8+雙陽性T細(xì)胞的百分比計算出2組研究對象外周血CTL的絕對值。

2 結(jié) 果

2.1試驗組與對照組外周血LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平比較 對2組外周血LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平進(jìn)行方差齊性檢驗，2組的LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平方差齊。采用t檢驗對2組外周血LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，試驗組LA水平高于對照組，淋巴細(xì)胞計數(shù)和CTL水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 試驗組與對照組LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平比較

2.2不同TNM分期口腔鱗癌患者外周血LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平比較 對Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者外周血LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平進(jìn)行方差齊性檢驗，2組不同TNM分期口腔鱗癌患者的LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平方差齊。采用t檢驗對2組不同TNM分期口腔鱗癌患者外周血LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者的LA水平高于Ⅰ～Ⅱ期，CTL水平低于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而淋巴細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同TNM分期口腔鱗癌患者LA、淋巴細(xì)胞計數(shù)及CTL水平比較

2.3口腔鱗癌患者LA水平與CTL水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，隨著口腔鱗癌患者LA水平升高，CTL水平相應(yīng)降低，其LA水平與CTL呈負(fù)相關(guān)(r=-0.551，P<0.05)，見圖1。

圖1 口腔鱗癌患者LA水平與CTL間關(guān)系散點圖

3 討 論

口腔鱗癌患者LA水平與健康者比較明顯升高，說明腫瘤細(xì)胞糖酵解作用增強(qiáng),使pH值下降。腫瘤微環(huán)境的缺氧狀態(tài)可以上調(diào)編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和LA脫氫酶基因，從而增加了LA的分泌，且糖酵解作用也產(chǎn)生大量LA。GATENBY等[4]提出腫瘤細(xì)胞的這種“糖酵解代謝”具有生長優(yōu)勢，是人類侵襲性癌癥進(jìn)化的必要條件。WALENTA等[5-7]發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中LA水平與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率以及癌癥患者總體生存率的降低之間存在相關(guān)性。FISCHER等[2]的研究中也提示了140例患有不同實體腫瘤的患者血清LA水平與腫瘤負(fù)荷之間可能相關(guān)。本研究顯示，在不同臨床分期的口腔鱗癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者LA水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，表明LA水平與口腔鱗癌的發(fā)展可能相關(guān)，這一指標(biāo)對預(yù)測腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有一定的指導(dǎo)意義。

口腔鱗癌患者外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)水平明顯低于健康者(P<0.05)，與機(jī)體抗腫瘤免疫有關(guān)，說明細(xì)胞免疫在口腔鱗癌中發(fā)揮著重要作用。但在不同分期的口腔鱗癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者同Ⅰ～Ⅱ期口腔鱗癌患者比較，外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可能是由于隨著腫瘤的進(jìn)展，主要是CTL的作用逐漸減弱[8]，淋巴細(xì)胞亞群比例發(fā)生變化，而淋巴細(xì)胞計數(shù)作為口腔鱗癌進(jìn)展程度的篩查指標(biāo)靈敏度較差。

根據(jù)SAVINA等[9]的研究結(jié)果，針對腫瘤抗原的有效免疫反應(yīng)需要活化和募集CD8+T細(xì)胞，從而發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)。本研究中口腔鱗癌患者相對健康者而言，發(fā)揮細(xì)胞毒作用的CD8+T細(xì)胞水平明顯降低，且口腔鱗癌晚期患者相對于早期患者而言，CTL下降更為明顯(P<0.05)，也反映了腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中機(jī)體免疫監(jiān)視狀況的變化，越是進(jìn)展到口腔鱗癌的晚期，CTL水平的下降越明顯，從而更有利于癌細(xì)胞的浸潤生長。FISCHER等[2]的研究中顯示，浸潤性CTL在進(jìn)入腫瘤部位后不久就失去了重要的功能，其關(guān)鍵特征是細(xì)胞溶解能力受阻?？谇击[癌可來源于一些惡性病變，如黏膜白斑。如果病變提示口腔上皮發(fā)育不良，則惡性轉(zhuǎn)化的可能性增加[10]。機(jī)體免疫系統(tǒng)在識別腫瘤前體細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。根據(jù)免疫監(jiān)視和免疫編輯假說，腫瘤細(xì)胞可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。這個假說認(rèn)為宿主和惡性細(xì)胞之間的相互作用是由3個階段驅(qū)動的，即消除期、平衡期、逃逸期。一些腫瘤細(xì)胞在消除階段被識別并清除，一些惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠存活至平衡期。在逃逸期，持續(xù)生存的細(xì)胞增殖為腫瘤[11]。口腔鱗癌患者中也存在著明顯的細(xì)胞免疫功能降低。

LA水平與CTL的相關(guān)性分析顯示，隨著口腔鱗癌患者LA水平升高，CTL水平相應(yīng)降低，說明腫瘤細(xì)胞特有的代謝特征會對機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，并在口腔鱗癌的進(jìn)展中發(fā)揮作用。LA可以抑制人CTL的增殖，從而利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移生長。LA酸中毒常見于大多數(shù)實體瘤患者，且影響免疫細(xì)胞的浸潤[12]。單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(MCT-1)是細(xì)胞轉(zhuǎn)運LA的蛋白，在心臟、肝臟、小腸、骨髓、骨骼肌、脾臟、大腦等組織中高表達(dá)[13]，其對LA的轉(zhuǎn)運依賴于細(xì)胞質(zhì)與胞外LA的水平梯度。有報道指出淋巴細(xì)胞也有MCT-1、MCT-2、MCT-4的表達(dá)[14]。腫瘤微環(huán)境中高水平的LA阻礙了MCT-1向T細(xì)胞外轉(zhuǎn)運LA，從而干擾了T細(xì)胞的代謝和功能，影響機(jī)體的免疫功能?；罨腡細(xì)胞利用糖酵解作用依賴于LA的有效分泌[15]。如果LA積累在細(xì)胞內(nèi)，則會干擾其新陳代謝，最終抑制CTL的增殖和活化?？谇击[癌患者在LA升高的同時伴隨著CTL的下降，可能與腫瘤微環(huán)境中高水平LA的積累有關(guān)。

綜上所述，口腔鱗癌患者外周血LA水平的增高伴隨著CTL水平的下降，說明癌細(xì)胞的糖酵解代謝可能會對機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，提示了口腔鱗癌患者腫瘤微環(huán)境中高水平的LA積累使CTL中的LA分泌受阻，干擾了T細(xì)胞代謝，抑制其細(xì)胞毒性效應(yīng)的發(fā)揮。外周血LA和CTL水平與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可以作為潛在的口腔鱗癌病情評估的篩查指標(biāo)。