鄭源任，李云婷，馮奇桃，李詩陽，林芳崇

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科,海南?？?570000

膿毒癥是感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，腎是最易受累器官之一，膿毒癥“細(xì)胞因子風(fēng)暴”可引起急性腎損傷(AKI)和死亡[1]。早期預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI具有重要意義，微小RNA(miR)是具有基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成調(diào)控的內(nèi)源性非編碼RNA，在維持體內(nèi)平衡中具有重要作用，其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，miR在AKI中表達(dá)異常，對AKI診斷、預(yù)后預(yù)測具有潛在作用[2]。缺血再灌注損傷是引起AKI的主要原因，急性腎小管壞死或細(xì)胞凋亡是AKI的主要病理基礎(chǔ)，miR-107-5p參與腎小管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控機(jī)制[3]。miR-210是缺血調(diào)控關(guān)鍵因子，參與腎臟缺血再灌注損傷過程，在AKI患者血漿中水平上調(diào)，與AKI臨床分期明顯相關(guān)[4]。本研究檢測膿毒癥患者血漿miR-107-5p、miR-210水平，探討其與膿毒癥并發(fā)AKI腎功能、炎癥指標(biāo)以及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床診治、預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年5月至2020年3月我院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)收治的210例膿毒癥患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)膿毒癥診斷參考?xì)W洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)年齡18～70歲；(3)既往無膿毒癥病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病患者；(2)既往有腎病綜合征、腎小球腎炎、腎癌等原發(fā)性腎臟疾病病史患者；(3)入住ICU后48 h內(nèi)死亡者。采集患者入院24 h內(nèi)的一般人口學(xué)資料(年齡、性別)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)疾病、感染部位、膿毒癥分級(膿毒癥、膿毒癥休克[6])、床旁監(jiān)護(hù)儀記錄的入院24 h平均動(dòng)脈壓(MAP)及平均心率(HR)。其中男118例，女92例；年齡18～70歲，平均(51.03±4.02)歲；膿毒癥146例，膿毒癥休克64例。根據(jù)是否并發(fā)AKI將210例患者分為AKI組(86例)和NAKI組(124例)。AKI患者符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]:48 h內(nèi)血肌酐(Scr)升高≥26.5 μmol/L；7 d內(nèi)Scr升至≥1.5倍基線值；連續(xù)6 h尿量<0.5 mL/(kg·h)；排除系統(tǒng)紅斑狼瘡、創(chuàng)傷、大手術(shù)后等其它因素引起的腎損傷。AKI組和NAKI組臨床基本資料比較，年齡、膿毒癥分級比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而性別、BMI、基礎(chǔ)疾病、感染部位、MAP、HR比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患者家屬均知情同意并簽署同意書，診療期間保障患者隱私和安全。

1.2方法

1.2.1急性生理與慢性健康狀況評價(jià)Ⅱ(APACHEⅡ)評分 APACHEⅡ評分根據(jù)患者入ICU 24 h內(nèi)臨床指標(biāo)(體溫、HR、呼吸、MAP、血氧分壓、電解質(zhì)、肌酐、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、神經(jīng)功能等)最差值計(jì)算[8]。

1.2.2腎功能、炎癥指標(biāo)及miR-107-5p、miR-210水平檢測 于入院24 h內(nèi)采集外周靜脈血6 mL，平均分裝于干燥試管和EDTA抗凝管，干燥試管標(biāo)本用于檢測腎功能和炎癥指標(biāo)，EDTA抗凝管標(biāo)本用于檢測血漿miR-107-5p、miR-210相對水平。血標(biāo)本均以離心半徑10 cm，3 000 r/min離心10 min，分離血清、血漿-80 ℃保存于超低溫冰箱。采用AU400全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)檢測血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在Model 550酶標(biāo)儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)上檢測血清胱抑素C(Cys-C)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)水平，試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-107-5p、miR-210水平，方法如下：取血漿標(biāo)本加入Trizol(美國Invitrogen公司)充分混勻，提取總RNA，使用ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國NanoDrop公司)檢測RNA純度和完整性，選擇A260/A280比值為1.8～2.0的RNA樣品，而后按照試劑盒說明加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre公司)將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)檢測miR-107-5p、miR-210水平。引物合成及序列測定由上海基康公司完成，序列如下：miR-107-5p上游引物為5′-GGAGCAGCATTGTACAGG-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′；miR-210上游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物為5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′。以U6為內(nèi)參，U6上游引物為5′-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3′，下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6 snRNA 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算各組的miR-107-5p、miR-210相對水平，共做3次平行試驗(yàn)，取平均值，其中ΔΔCtmiR-107-5p=ΔCtmiR-107-5p-ΔCtU6 snRNA，ΔΔCtmiR-210=ΔCtmiR-210-ΔCtU6 snRNA。

表1 AKI組與NAKI組臨床基本資料

組別n感染部位[n(%)]泌尿系統(tǒng)導(dǎo)管相關(guān)血流感染腹腔感染其他膿毒癥分級[n(%)]膿毒癥膿毒癥休克MAP(x±s,mm Hg)HR(x±s,次/分)AKI組8623(26.74)29(33.72)21(24.42)13(15.12)51(59.30)35(40.70)102.35±6.3593.35±7.18NAKI組12437(29.84)40(32.26)35(28.23)12(9.68)95(76.61)29(23.39)103.24±6.4292.76±7.09t/χ21.7417.1820.9930.590P0.6280.0070.3220.556

1.2.3隨訪 統(tǒng)計(jì)膿毒癥并發(fā)AKI患者入院28 d內(nèi)存活情況，將存活患者歸為存活組，死亡患者歸為死亡組。

2 結(jié) 果

2.1AKI組與NAKI組APACHEⅡ評分及miR-107-5p、miR-210、腎功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)水平比較 AKI組APACHEⅡ評分，以及miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT水平均高于NAKI組(P<0.05)，見表2。

表2 AKI組與NAKI組APACHEⅡ評分及miR-107-5p、miR-210、腎功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)水平比較

2.2AKI組miR-107-5p、miR-210水平與腎功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)相關(guān)性 AKI組miR-107-5p、miR-210水平與BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 miR-107-5p、miR-210水平與腎功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)的相關(guān)性

2.3不同預(yù)后膿毒癥并發(fā)AKI患者的miR-107-5p、miR-210、腎功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)水平比較 根據(jù)患者入院28 d內(nèi)預(yù)后情況，將86例膿毒癥并發(fā)AKI患者分為死亡組和存活組，其中死亡組33例(38.37%)，死亡組53例(61.63%)。死亡組的miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT水平高于存活組(P<0.05)，見表4。

表4 不同預(yù)后膿毒癥并發(fā)AKI患者miR-107-5p、miR-210、腎功能指標(biāo)、炎癥指標(biāo)水平比較

2.4影響膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后的因素 以膿毒癥并發(fā)AKI患者28 d存活情況為因變量(賦值：0=存活，1=死亡)，以年齡、性別(賦值：0=女，1=男)、基礎(chǔ)疾病(賦值：0=糖尿病，1=高血壓，2=冠心病，3=高脂血癥)、感染部位(賦值：0=泌尿系統(tǒng)，1=導(dǎo)管相關(guān)血流感染，2=腹腔感染，3=其他)、膿毒癥分級(賦值：0=膿毒癥，1=膿毒癥休克)、MAP、HR、APACHEⅡ評分、miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT為自變量，建立Cox比例危險(xiǎn)模型。單因素Cox比例回歸分析顯示，BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT、APACHEⅡ評分、miR-107-5p、miR-210與膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，見表5。多因素Cox比例回歸分析顯示，Cys-C、miR-210、miR-107-5p是膿毒癥并發(fā)AKI患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表6。

表5 影響膿毒癥并發(fā)急性腎損傷患者預(yù)后的單因素Cox比例回歸分析

表6 影響膿毒癥并發(fā)急性腎損傷患者預(yù)后的多因素Cox比例回歸分析

2.5miR-107-5p、miR-210對膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后的預(yù)測效能 繪制miR-107-5p、miR-210預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示，當(dāng)miR-107-5p、miR-210的最佳臨界值為6.91、7.03時(shí)，二者預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后的AUC為0.878(95%CI：0.798～0.959)、0.814(95%CI：0.717～0.912)，靈敏度為81.82%、84.85%，特異度為84.91%、81.13%，約登指數(shù)為0.67、0.66，見圖1。

圖1 miR-107-5p、miR-210預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

膿毒癥是一種常見的致命疾病，AKI是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一，膿毒癥并發(fā)AKI的病理生理機(jī)制尚不清楚，可能與腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、微血管功能障礙、炎性反應(yīng)以及對炎癥損傷的代謝反應(yīng)等有關(guān)。膿毒癥患者病死率與器官功能障礙有關(guān)，并發(fā)AKI可使膿毒癥患者病死率增加6-8倍[9]。目前缺乏預(yù)測膿毒癥患者并發(fā)AKI的靈敏度和特異度高的指標(biāo)，導(dǎo)致AKI錯(cuò)過最佳診治時(shí)機(jī)。miR主要通過與mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，組織特異性強(qiáng)，半衰期長，可穩(wěn)定存在于外周血液中，逐漸成為疾病診斷、預(yù)后判斷的無創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo)[10]。

miR-107-5p是miR-107家族成員之一，在人類心臟、骨骼肌、大腦、肺、肝、腎、脾和胎盤中廣泛而穩(wěn)定表達(dá)，在細(xì)胞對缺血應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[11]。既往研究顯示，miR-107-5p異常表達(dá)與缺血性腦梗死[11]、肥胖[12]、腫瘤[13]和腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，AKI組miR-107-5p水平較NAKI組升高(P<0.05)，說明miR-107-5p可能參與了膿毒癥并發(fā)AKI發(fā)病過程，這是因?yàn)楦腥疽鸬哪I血流量減少是膿毒癥并發(fā)AKI的主要病理基礎(chǔ)，內(nèi)皮細(xì)胞的激活在膿毒癥并發(fā)AKI中起關(guān)鍵作用，膿毒癥期間病原菌刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量炎癥因子，引起腎小管細(xì)胞損傷[15]。BUN、Scr、Cys-C是腎損傷診斷的重要指標(biāo)，Cys-C可敏感反映腎小球?yàn)V過率。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-107-5p水平與BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相關(guān)(r=0.619、0.535、0.785、0.542、0.553,P<0.05)，說明miR-107-5p可能在膿毒癥患者炎性反應(yīng)、腎損傷中發(fā)揮調(diào)控作用，參與AKI發(fā)病過程。可能的機(jī)制為miR-107-5p靶向內(nèi)皮細(xì)胞中雙重特異性磷酸酶7，促使紋狀體細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α分泌，進(jìn)而介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞收縮、E-鈣黏蛋白分泌減少、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶釋放和腎小管細(xì)胞損傷凋亡，導(dǎo)致Scr水平升高，腎損傷加重[3]。miR-107-5p還可靶向核糖體蛋白S19，抑制核糖體蛋白S19表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，促使其凋亡[16]。

miR-210是重要的缺氧誘導(dǎo)基因，位于人類11p15.5染色體，受缺氧調(diào)控因子(HIF)1α、HIF2α調(diào)控，缺氧轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB也可與miR-210結(jié)合，誘導(dǎo)miR-210表達(dá)[17]。miR-210具有調(diào)控細(xì)胞周期、促使干細(xì)胞存活、抑制線粒體代謝、促使細(xì)胞分化、誘導(dǎo)血管生成等作用[17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在腎損傷中表達(dá)異常，參與腎臟缺血再灌注損傷過程[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在AKI組中水平明顯升高，與LORENZEN等[19]報(bào)道結(jié)果一致；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-210與BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相關(guān)(r=0.596、0.632、0.705、0.512、0.547,P<0.05)，提示miR-210參與膿毒癥患者腎損傷過程。miR-210參與膿毒癥并發(fā)AKI的機(jī)制可能為膿毒癥患者伴隨的炎性反應(yīng)影響了腎臟局部血流動(dòng)力學(xué)，引發(fā)腎臟缺血再灌注損傷，導(dǎo)致腎臟局部缺氧，刺激HIF表達(dá)，miR-210作為HIF靶基因和靶分子，在HIF過度活化下表達(dá)明顯上調(diào)[18]。miR-210過表達(dá)可發(fā)揮負(fù)向調(diào)控HIF作用，通過靶向腎小管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1抑制因子mRNA 3′UTR，直接抑制HIF-1表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，進(jìn)而降低腎臟缺氧性損傷[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-210、miR-107-5p在膿毒癥并發(fā)AKI患者死亡組中的水平高于存活組，Cox回歸分析結(jié)果顯示，miR-210、miR-107-5p是膿毒癥并發(fā)AKI患者死亡的危險(xiǎn)因素(OR=2.149、2.115,P<0.05)，說明miR-210、miR-107-5p水平增高可能預(yù)示著不良臨床結(jié)局的發(fā)生，miR-210、miR-107-5p可以為預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI患者的預(yù)后提供有價(jià)值的信息。ROC曲線分析miR-210、miR-107-5p預(yù)測膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后的AUC為0.878(95%CI：0.798～0.959)、0.814(95%CI：0.717～0.912)，靈敏度和特異度均在80%以上，證實(shí)miR-210、miR-107-5p對膿毒癥并發(fā)AKI患者的預(yù)后有預(yù)測價(jià)值，同時(shí)提示對于miR-210、miR-107-5p水平升高的膿毒癥并發(fā)AKI患者應(yīng)高度警惕不良臨床結(jié)局的發(fā)生。LORENZEN等[19]報(bào)道m(xù)iR-210是膿毒癥并發(fā)AKI患者28 d死亡的獨(dú)立預(yù)測因子。本研究回歸分析同樣顯示，Cys-C與膿毒癥并發(fā)AKI患者28 d生存狀況有關(guān)，Cys-C是慢性腎衰竭、AKI診斷的敏感指標(biāo)，可用于預(yù)測AKI患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[21]。

綜上所述，膿毒癥并發(fā)AKI患者血漿miR-107-5p、miR-210水平較未并發(fā)AKI患者明顯增高，二者水平升高與腎損傷程度、炎性反應(yīng)程度和不良預(yù)后相關(guān)，并有望成為膿毒癥并發(fā)AKI患者預(yù)后評估的潛在生物學(xué)標(biāo)志物和臨床治療的新靶點(diǎn)。