廖 帆，楊雅娣，譚 磊

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的腸道傳染病，由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起，該病具有急性和高度接觸性等特點[1]。仔豬感染PEDV后可表現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，如嘔吐、消瘦和持續(xù)性腹瀉等，并出現(xiàn)高死亡率。近來年，PED仍然是導(dǎo)致我國仔豬腹瀉的主要腸道病原之一，大部分豬場暴發(fā)PED由PEDV變異株感染所致，少數(shù)則由PEDV傳統(tǒng)株感染引起，使得目前我國PED的防控較為嚴(yán)峻[2]。由于發(fā)病仔豬在短時間內(nèi)會出現(xiàn)死亡，對PED進(jìn)行及時而準(zhǔn)確的診斷對該病的防控極為重要，本次研究采用RT-PCR技術(shù)對某規(guī)模化豬場疑似感染PEDV的仔豬腸道組織進(jìn)行病原診斷，并對PEDV毒株的ORF3基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，確定導(dǎo)致仔豬發(fā)病的PEDV毒株類型，為相應(yīng)的防控措施制定提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源

12份樣品來源于湖南省某規(guī)?；i場，該場于2018年9月初暴發(fā)腹瀉，樣品均為帶有腹瀉癥狀的仔豬腸道組織及其內(nèi)容物。

1.2 試驗材料

Trizol Regent購買于美國賽默飛公司；反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購自于美國Promega公司；PCR試劑及DNA marker分別購自于長沙擎科生物有限公司和北京全式金生物有限公司；其它耗材購自于深圳華大基因股份有限公司；PCR儀購自于美國ABI公司；不同規(guī)格移液器和低溫冷凍離心機(jī)等購自于美國。參考文獻(xiàn)[3]合成ORF3基因擴(kuò)增引物，引物由長沙擎科生物科技有限公司合成。

1.3 樣品的處理及組織RNA提取

取1.0 g左右組織樣品，剪碎，置于2.0 mL的離心管中，加入適量生理鹽水后勻漿，其后反復(fù)凍融3次，低溫高速（12 000 r/min）離心15 min，取上清液。采用Trizol法提取組織RNA，RNA樣品保存于-80 ℃。

1.4 PEDV ORF3基因PCR擴(kuò)增、克隆與測序

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA制備為cDNA，以cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：上下游引物各2 μL、cDNA模板2 μL、2×easy taq mix 25 μL、無RNA酶水19 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，在紫外線下觀察是否有目的條帶。將陽性樣品片段切膠，回收，連接至PUCM-T載體，將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切驗證，陽性克隆送長沙擎科生物科技有限公司測序。

1.5 序列分析

從NCBI中選取國內(nèi)外具有代表性的PEDV分離株ORF3基因作為參考序列，應(yīng)用DNAstar軟件對不同毒株核苷酸/氨基酸序列同源性進(jìn)行分析，明確其基因變異情況，應(yīng)用Mega 5.0軟件中NJ法構(gòu)建不同毒株的種系遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 樣品RT-PCR檢測結(jié)果

對采自湖南省邵陽市某規(guī)?；i場的12份樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中3份（1號、5號、7號）為PEDV陽性（圖1），其電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期一致。

圖1 12份腸道組織PEDV病原檢測電泳

2.2 菌液PCR及質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果

將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆后，將假定陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒提取后，使用內(nèi)切酶（Ecor I和Not I）對樣品進(jìn)行酶切，酶切驗證結(jié)果顯示質(zhì)粒被切為2個片段，分別為載體（約2 700 bp）和目的基因片段（約750 bp），詳見圖2。

圖2 酶切驗證凝膠電泳

2.3 ORF3序列遺傳進(jìn)化樹分析

3份陽性樣品分別標(biāo)記為PEDV-1、PEDV-2和PEDV-3，將ORF3基因序列兩端多余序列切除，得到ORF3基因序列大小均為675 bp。將PEDV-1、PEDV-2和PEDV-3的ORF3基因序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，其序列無核苷酸缺失或插入的現(xiàn)象，僅出現(xiàn)個別核苷酸突變，3株P(guān)EDV分離株的ORF3基因序列的同源性為99.2%～100.0%，其中PEDV-1和PEDV-2分離株同源性為100.0%，3個分離株與PEDV變異株的同源性為98.8%～99.9%，但與PEDV CV777疫苗毒株同源性較低，為95.4%～96.3%。

進(jìn)一步分析ORF3基因與國內(nèi)外PEDV毒株的親緣關(guān)系，將所得的3條ORF3基因序列與從GenBank中下載的15株國內(nèi)外PEDV ORF3序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)本次研究獲得的PEDV毒株均與GenBank收錄的PEDV變異株聚為一個分支，與其它PEDV弱毒株或傳統(tǒng)毒株相隔較遠(yuǎn)。

圖3 PEDV ORF3序列遺傳進(jìn)化樹

3 討論

自2010年來，PEDV開始廣泛流行，從眾多的研究中不難發(fā)現(xiàn)，這是由于PEDV變異株出現(xiàn)導(dǎo)致的。在此之前，由于PEDV滅活疫苗及弱毒疫苗的廣泛且有效的接種，使PED的流行趨勢一度得到有效控制，但可能正是由于這些疫苗的長期廣泛的使用及外界環(huán)境等因素造成易感豬群免疫力下降，且在此期間發(fā)生了基因變異現(xiàn)象，從而出現(xiàn)了PEDV變異株。其次，PEDV 屬于RNA病毒，由于RNA聚合酶缺乏修正功能，這無疑加大了PEDV在復(fù)制過程中發(fā)生變異的幾率[4]。

檢測PEDV病原的技術(shù)有很多種，本試驗采用RT-PCR法對采得樣品中PEDV病原進(jìn)行檢測。通過對發(fā)病豬場收集的樣品進(jìn)行PEDV病原檢測發(fā)現(xiàn)，12份被檢測樣品中有3份檢測為PEDV陽性，其陽性率為25.0%，由此推斷該豬場仔豬腹瀉可能由PEDV感染所引起。

ORF3基因編碼PEDV唯一輔助蛋白，與病毒的毒力強(qiáng)弱有關(guān)，其編碼產(chǎn)物為離子通道蛋白，能調(diào)控病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖[5]。陳如敬等[6]通過對PEDV FJ-11A分離株ORF3基因與國內(nèi)外PEDV參考毒株的序列分析發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)ORF3基因序列特征區(qū)分野毒株與疫苗株、弱毒株；進(jìn)一步建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見PEDV在遺傳進(jìn)化上主要呈現(xiàn)兩個分支，其中PEDV疫苗株和弱毒株聚為一個分支，而PEDV變異株位于另一分支上，兩者相聚較遠(yuǎn)。在本研究中，通過對該豬場3個PEDV陽性樣品的ORF3基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序與分析發(fā)現(xiàn)，3個PEDV分離株ORF3基因片段大小均為675 bp，其核苷酸同源性為99.2%～100.0%，與PEDV變異株的同源性為98.8%～99.9%，但與PEDV CV777毒株同源性較低，為95.4%～96.3%；系統(tǒng)種系發(fā)育樹結(jié)果顯示本次研究獲得的PEDV分離株均與PEDV變異株聚為一個分支，與PEDV弱毒疫苗或傳統(tǒng)毒株所屬分支相隔較遠(yuǎn)，提示該豬場暴發(fā)的PEDV毒株可能為變異株，因此針對PEDV變異株發(fā)生與流行的防控措施需要制定與緊急實施。