王葳 ，曹義娟 ，湯美玲 ，周曉燕

作者單位：1 皖北煤電集團總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，安徽 宿州 234000；2 徐州市中心醫(yī)院生殖中心，江蘇 徐州 221000

凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）是一種重要的輔助生殖技術(shù)，是對鮮胚移植未能獲得成功妊娠的有效補充措施，也是生育力保存的一種形式，在不同人群中均適用，尤其對于卵巢高反應(yīng)人群，可降低取卵后卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生率，提高活產(chǎn)率，降低流產(chǎn)率，成為了當(dāng)前生殖中心廣泛使用的治療方法。在研究及臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ET周期成功妊娠需一定的條件支撐，最基本的條件是優(yōu)質(zhì)的胚胎及良好的子宮內(nèi)膜環(huán)境。新鮮周期時已選擇優(yōu)質(zhì)的分裂胚或囊胚冷凍，F(xiàn)ET時主要還是子宮內(nèi)膜容受性的準(zhǔn)備。自然周期、促排卵周期、激素替代周期是目前各生殖中心較為經(jīng)典的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。本中心常用的觀察指標(biāo)為陰道超聲下子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜形態(tài)、雌二醇、黃體生成素（LH）及孕酮值，通過參考這些指標(biāo)，在合適的時機應(yīng)用孕激素使子宮內(nèi)膜從增生期向分泌期轉(zhuǎn)化，在理論“種植窗”內(nèi)移植分裂胚或囊胚。而實際上很多 FET 的病人在具備以上條件時行 FET 未能獲得妊娠。此時除了考慮胚胎自身發(fā)育潛能，也要考慮子宮內(nèi)膜的發(fā)育 和胚胎是否同步。臨床中發(fā)現(xiàn)激素替代周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜進行FET 的病人，在外源性雌激素作用下，垂體的反應(yīng)性不一，LH 值差距較大。本研究針對在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日LH＜13 U∕L的病人 ，予肌注人絨毛膜促性腺激素（hCG）10 000 U，結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將 2018年 1月至 2019年 12月在皖北煤電集團總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行 FET 激素替代方案助孕治療共 271 個周期納入本次研究中，研究對象擬內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日檢測血中雌二醇≥549 pmol∕L，孕酮＜4.76 nmol∕L，排除子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水、宮腔粘連、子宮畸形、數(shù)據(jù)資料不全等病人。病人年齡（30.96±5.56）歲，范圍為 20～45歲。其中內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日低 LH 時使用 hCG 組 45周期為 hCG 組，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日低 LH 時未使用 hCG 組 95周期為對照組。所有未使 用 hCG 的病人 ，LH≥13 U∕L 組 131周期為高 LH組，LH＜13 U∕L 組 95周期為低LH組（即前面對照組）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人或其近親屬對研究方 案簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備月經(jīng)周期的第2～3 d 根據(jù)內(nèi)膜和基礎(chǔ) FSH、LH、雌二醇水平開始口服雌激素，雌激素的使用有兩種方法：（1）戊酸雌二醇片 4 mg∕d（補佳樂，1 mg，德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司），（2）雌二醇片 4 mg∕d（芬嗎通紅片，2 mg，荷蘭雅培公司），服藥 8～10 d 后陰道 B 超監(jiān)測病人子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜型態(tài)，根據(jù)內(nèi)膜厚度適當(dāng)調(diào)整雌激素劑量，若內(nèi)膜厚度＜6 mm，添加 1～2 mg 芬嗎通紅片口服或陰道放置，直至病人子宮內(nèi)膜厚度在 7 mm 以上，此時測定病人血清雌二醇、LH、孕酮水平，若雌二醇≥549 pmol∕L，LH＜13 U∕L 且孕酮＜4.76 nmol∕L，hCG 組當(dāng)日上午 10：00—12：00 肌注 hCG 10 000 U（批 次180702，180801，批 號 H44020672，5 000 U，珠 海 麗珠公司），孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，方法有：（1）黃體酮 60 mg∕d（浙江仙居制藥）肌注+戊酸雌二醇片 4 mg∕d 口服+地屈孕酮片 20 mg∕d（達芙通，10 mg，荷蘭雅培公司）口服，（2）黃體酮 60 mg∕d 肌注+雌二醇∕地屈孕酮片 20 mg∕d（芬嗎通黃片，2∕10 mg，荷蘭雅培公司）口服。對照組及高 LH 組直接孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，方法同上。擬定解凍胚胎時間和胚胎移植時間。一般移植分裂胚在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日第4 天，移植囊胚在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日第6 天。

1.2.2 胚胎解凍 本科實驗室采用玻璃化冷凍方法進行胚胎冷凍，并將冷凍的胚胎置于-196 ℃的液氮罐儲存。胚胎解凍，按照（日本，加藤，玻璃化解凍液套裝）的解凍步驟解凍，同時聯(lián)合應(yīng)用激光輔助孵化技術(shù)，解凍復(fù)蘇后的胚胎放置胚胎培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為 6% 二氧化碳、19% 氧氣、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，現(xiàn)本科實驗室在移植前 1 d 解凍胚胎，培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，于解凍第2 天在腹部 B 超引導(dǎo)下行胚胎移植。

1.2.3 移植和黃體支持 在移植日經(jīng)腹部 B 超引導(dǎo)下進行胚胎移植（數(shù)目≤3 枚）。移植后繼續(xù)按原劑量使用補佳樂+地屈孕酮片+黃體酮注射液或芬嗎通黃片+黃體酮注射液支持黃體功能。移植當(dāng)天起每日肌注 hCG 2 000 U，隔日 1 次，共 3 次。移植后兩周查血 hCG 值確定是否生化妊娠。移植后四周陰道 B 超發(fā)現(xiàn) 1 個或多個孕囊確定為臨床妊娠，若妊娠終止于孕 12周前稱為早期流產(chǎn)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察各組病人在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日的子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜形態(tài)、血清雌二醇值、LH 值，比較各組病人解凍胚胎復(fù)蘇存活率、移植胚胎數(shù)、移植囊胚比率、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率之間的差異（本中心實驗室孕酮小于 0.15 nmol∕L 時均用＜0.15 nmol∕L 表示，故未比較孕酮值）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

hCG 組與對照組比較，年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、移植次數(shù)、不孕因素差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），見表1；高 LH 組與低 LH 組比較，年齡、不孕年限、移植次數(shù)、不孕因素差異無統(tǒng)計學(xué) 意 義（

P

＞0.05），高 LH 組體質(zhì)量指數(shù)較低（

P

＜0.05），見表2。

表1 人絨毛膜促性腺激素（hCG）治療組與對照組助孕病人一般情況比較

表2 不同黃體生成素（LH）水平助孕病人一般情況比較

2.2 激素替代周期指標(biāo)及臨床結(jié)局

高 LH 組與低LH 組比較，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度、分型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），高 LH 組雌二醇值較低、LH 值較高（

P

＜0.05）。胚胎復(fù)蘇存活率、移植胚胎數(shù)、移植囊胚比率及臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），高 LH 組胚胎種植率較高（

P

＜0.05），高 LH 組早期流產(chǎn)率較低（

P

＜0.05）。見表3。hCG 組與對照組比較，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度、分型 、雌二醇值 、LH 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）；胚胎復(fù)蘇存活率、移植胚胎數(shù)、移植囊胚比率及早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），胚胎種植 率 、臨床妊娠率 hCG 組高于對照組（

P

＜0.05）。見表4。

表3 不同黃體生成素（LH）水平助孕病人內(nèi)膜、激素及臨床結(jié)局比較

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，F(xiàn)ET 技術(shù)日益成熟并且穩(wěn)定，在具體應(yīng)用中，子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備是非常關(guān)鍵的操作，當(dāng)前常用的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案主要包括自然周期、促排卵周期、激素替代周期 3 種，而三種方案各有優(yōu)缺點，本中心多使用激素替代周期的方案，適用于存在排卵障礙的病人等，該方案模擬自然周期雌孕激素對子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的作用，有效調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生長規(guī)律，控制子宮內(nèi)膜“種植窗”的開放，并且通過負反饋抑制下丘腦垂體的功能。這種方式的胚胎移植周期更容易被操作者所接受，但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)垂體對外源性激素的作用反應(yīng)不一，LH 值差距較大。

LH 的作用貫穿了卵子發(fā)育、誘導(dǎo)排卵及胚胎種植的全過程。著床窗口期時，LH 與卵巢黃體細胞和子宮內(nèi)膜上的受體結(jié)合，維持黃體和內(nèi)膜的發(fā)育，改善子宮內(nèi)膜的容受性。動物實驗發(fā)現(xiàn) LH 受體在子宮內(nèi)膜腔上皮細胞、腺上皮細胞、基質(zhì)細胞、蛻膜細胞和動脈內(nèi)皮細胞上都有表達，在“種植窗”達到最高峰，認為 LH 是誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜著床局部發(fā)生顯著性變化的主要原因。LH 可以調(diào)節(jié)小鼠子宮的芳香化酶活性和孕烯醇酮的代謝，推測在激素替代周期中，外源性補充孕酮，并不能完全取代 LH 的作用。也有學(xué)者認為 LH 過高或提前出現(xiàn)對子宮內(nèi)膜容受性的產(chǎn)生不利影響，說明適當(dāng)?shù)?LH 是維持妊娠的必要條件。

表4 人絨毛膜促性腺激素（hCG）治療組與對照組助孕病人子宮內(nèi)膜、激素及臨床結(jié)局比較

hCG 和 LH 的 α 亞單位基本相同，hCG 半衰期較長，與 hCG∕LH 受體的結(jié)合能力也是 LH 的 6～8 倍，應(yīng)用后模擬 LH 峰，增加了作用時間和作用強度，且價格優(yōu)廉，使用廣泛。不僅如此，受精卵卵裂球在早期細胞階段通過 hCG 旁分泌與子宮內(nèi)膜進行信息傳遞。而體外培養(yǎng)及冷凍復(fù)蘇過程中可能存在hCG 的損耗和信息傳遞的缺失，外源性添加 hCG 可彌補胚胎和母體之間的前期交流過程。有研究顯示，hCG 可以通過上調(diào)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的受體（IL1R）來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞對白細胞介素-1的感受性。hCG 可有效抑制宮腔內(nèi)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1 與巨噬細胞集落刺激因子分泌，同時，還可有效促進利于胚胎著床的血管內(nèi)皮生長因子、白細胞抑制因子、基 質(zhì)金屬蛋白酶-9 等 的分泌。這些功能與血管生成有關(guān)，且良好的血供是促進胚胎發(fā)育的重要途徑。另一項研究發(fā)現(xiàn) hCG還可以調(diào)節(jié) Th1∕Th2 細胞之間的平衡，有利于胚胎種植及維持妊娠。

除了三種經(jīng)典的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案外，降調(diào)節(jié)+激素替代周期成為近年來的研究熱點，當(dāng)該方案出現(xiàn)低 LH 時添加 hCG 可進一步改善妊娠結(jié)局。反復(fù)移植失敗病人，F(xiàn)ET 移植前宮腔內(nèi)灌注 hCG 可改善胚胎種植率和臨床妊娠率?？紤]宮腔灌注 hCG增加宮腔操作，可能損傷子宮內(nèi)膜或增加感染風(fēng)險，簡化為注射 hCG 可能更為便捷。王薇等發(fā)現(xiàn)每日小劑量 hCG 在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前使用，也能夠改善FET 病人的子宮內(nèi)膜厚度、血流及妊娠結(jié)局。本次研究初步發(fā)現(xiàn)，在未添加 hCG 時，與高 LH 組相比，低 LH 組胚胎種植率降低，早期流產(chǎn)率升高。在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日肌注 hCG 的低 LH 病人，胚胎種植率、臨床妊娠率較對照組提高。這和前面提到適當(dāng)?shù)?LH 及hCG 對子宮內(nèi)膜容受性的影響相符合。后續(xù)研究在擴大樣本量的基礎(chǔ)上對 LH 水平進一步分組，尋求補充 hCG 的最適 LH 范圍和最小有效劑量。早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義說明持續(xù)妊娠除和內(nèi)膜相關(guān)還與胚胎發(fā)育潛能有關(guān)，后期還需要增大樣本量驗證。此外還發(fā)現(xiàn)，高 LH 組體質(zhì)量指數(shù)及雌二醇值較低，推測可能也與病人的藥物代謝和垂體反應(yīng)有關(guān)，可以進一步研究其中規(guī)律。

綜上所述，在 FET 激素替代周期中低 LH 影響胚胎種植及妊娠維持；發(fā)現(xiàn)低 LH 時在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日肌注 hCG 可以改善胚胎種植率，提高臨床妊娠率，但不能降低早期流產(chǎn)率。