趙志軍,趙 婷,3,劉延波,劉 寧,葛少華,潘春梅,孫西玉,5,*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院(酒業(yè)學(xué)院),河南鄭州 450046; 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450046; 3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068; 4.寶豐酒業(yè)有限公司,河南平頂山 467500; 5.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司,河南商丘 476733)

中國白酒作為我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品,是最古老的蒸餾酒之一[1-2],在世界享有盛譽[3]。白酒中的微量成分眾多[4],這些微量成分在各種白酒中的含量和比例不同,導(dǎo)致了白酒香型和風(fēng)格的多樣性。在白酒微量成分中,酯類含量最多且對白酒影響最大,是組成白酒香味的主要物質(zhì)[1,5]。

紅曲菌(Monascussp.)又叫紅曲霉[6],是我國傳統(tǒng)的藥食兩用微生物資源[7]。紅曲菌的用途十分廣泛,在釀酒[8-9]、食品加工[10]、色素合成[11]及藥物制備[12]等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用價值。紅曲菌在生長代謝過程中能產(chǎn)生酯化酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶類,其酯化酶可以催化己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒中香味物質(zhì)的形成[13-15]。從中國白酒釀造大曲中分離出酯化型紅曲霉,并進(jìn)一步提升其產(chǎn)酯化酶能力,對白酒品質(zhì)提高非常有意義。

目前,菌種改良的遺傳策略有隨機(jī)誘變、雜交育種和基因工程技術(shù)等手段[16-17],其中隨機(jī)誘變育種具有簡單、快速、有效等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)菌種的選育[18]。物理誘變因操作簡單、易于環(huán)保及對人體傷害小等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用[19]。常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變育種技術(shù)是利用等離子體射流中富含的化學(xué)活性粒子直接作用于細(xì)胞遺傳物質(zhì),從而引發(fā)多類形式的DNA損傷,產(chǎn)生突變菌株[20]。同時該方法具有無污染和操作安全簡單的優(yōu)點,在微生物育種和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[21]。紫外(Ultraviolet,UV)誘變利用紫外線輻射微生物DNA分子,形成嘧啶二聚體影響堿基的正常配對,從而引起突變[22]。該方法因其設(shè)備簡單、易于操作,是最為常用的菌種誘變手段。一般認(rèn)為復(fù)合誘變具有協(xié)同作用,其效果會比單一誘變效果更好[23]。

本研究以前期從釀酒大曲中分離獲得的紅曲菌為出發(fā)菌株進(jìn)行UV-ARTP復(fù)合誘變,篩選高產(chǎn)酯化酶的突變菌株,采用單因素實驗確定各因素對菌株產(chǎn)酯化酶能力的影響,選取顯著性較強的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,以期得到高酯化力的紅曲菌并探索其最佳培養(yǎng)條件,為白酒品質(zhì)的提高提供優(yōu)良菌株來源及應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三株紅曲菌(N1,N2,N3) 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)中心從大曲中分離并保藏;馬鈴薯,麩皮、稻殼 市售;氯化鈉、乙醇、己酸 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三丁酸甘油酯(分析純)、己酸乙酯(色譜純)、乙酸正戊酯(色譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;斜面固體培養(yǎng)基:將200 g馬鈴薯(去皮)切成小塊,加入1000 mL蒸餾水,煮沸30 min,紗布過濾,然后加入20 g葡萄糖及20 g瓊脂,加熱攪拌溶解,補足水分至1000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min;篩選培養(yǎng)基[24]:馬鈴薯(去皮)20%,蔗糖2%,三丁酸甘油酯0.4%,瓊脂2%,自然pH,121 ℃滅菌20 min;固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:25 g的麩皮調(diào)整含水率為65%裝入250 mL三角瓶,121 ℃滅菌30 min。

磁力攪拌器 江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠;LDZX-50KBS立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;GH-500隔水式培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變育種儀 洛陽華清天木生物科技有限公司;Agilent 7890A氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 初始菌株酯化酶活力測定 將三株初始菌株分別接種至斜面固體培養(yǎng)基中,28 ℃活化制成孢子懸浮液。按4%的比例將孢子懸浮液分別接種于固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,每24 h搖瓶一次,培養(yǎng)6 d。成熟后,將固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基倒于已滅菌的牛皮紙上于鼓風(fēng)干燥箱中35 ℃快速烘干,密封袋保存。

采用氣相色譜法測定紅曲菌麩曲酯化力[25]的方法。酯化力(以己酸乙酯計)定義為:1 g干曲粉在30 ℃反應(yīng)100 h所產(chǎn)生的己酸乙酯毫克數(shù),單位為mg/(g·100 h),以U/g表示。

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 孢子懸液的制備 選取酯化酶活力較高的菌株作為初始菌株,接種于試管斜面上,28 ℃活化培養(yǎng)7 d。向菌種斜面中加入適量無菌生理鹽水,用無菌接種環(huán)輕輕刮洗孢子,倒入已滅菌并裝有玻璃珠的三角瓶中,用玻璃珠將孢子充分打散。用血球計數(shù)板測定,用無菌生理鹽水稀釋孢子濃度至106個/mL,制得誘變用孢子懸液。

1.2.2.2 UV-ARTP復(fù)合誘變 將30 W紫外燈預(yù)熱20 min,將裝有孢子懸液的培養(yǎng)皿放到磁力攪拌器上,調(diào)節(jié)其與燈管垂直距離為30 cm,打開皿蓋紫外照射,分別選擇照射處理時間為0、30、60、90、120、150 s。結(jié)束后,避光穩(wěn)定10 min,用移液槍取出被照射的孢子懸液0.1 mL,梯度稀釋后,涂布至篩選培養(yǎng)基上,將平板倒置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d,計數(shù)并測定單個菌落的透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)[26]。

將紫外誘變后D/d值大的菌株制成孢子懸液,取10 μL均勻涂抹在金屬菌物載片表面,用鑷子將菌物載片轉(zhuǎn)移到載物臺,設(shè)定參數(shù)在工作氣流量為10 L/min,等離子體發(fā)射源與樣品距離為2 mm,操作溫度由26 ℃逐步上升并穩(wěn)定至35 ℃的條件下,分別處理20、35、50、65、80、95 s,處理后將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL生理鹽水的EP管中,振蕩洗脫形成新的菌懸液。將誘變后和未誘變的菌懸液分別取0.1 mL稀釋適當(dāng)梯度涂布于篩選培養(yǎng)基上,培養(yǎng)6 d后觀察菌落形態(tài)特征。采用平板活菌計數(shù)法來計算誘變致死率[27]。

1.2.3 篩選方法

1.2.3.1 突變菌株的初篩 將誘變后菌株接種至篩選培養(yǎng)基,平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。觀察菌落周圍出現(xiàn)的透明圈大小和菌落顏色的變化,并測量D/d值,選擇其比值大且菌落直徑也比較大及顏色深的菌落進(jìn)行菌株純化,劃線至斜面培養(yǎng)基,備用。

1.2.3.2 突變菌株的復(fù)篩 突變菌株酯化酶活力的測定,見1.2.1。

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性實驗 將UV-ARTP復(fù)合誘變處理后篩選得到的高產(chǎn)酯化酶紅曲菌突變菌株轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基中,在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)6 d,連續(xù)傳代5次,分別在固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測定其酯化酶活力,驗證此突變菌株產(chǎn)酶活力的穩(wěn)定性。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 接種量對菌株酯化力的影響 固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入2%、3%、4%、5%、6%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下培養(yǎng)6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.2 含水量對菌株酯化力的影響 分別為60%、65%、70%、75%、80%含水量的固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下培養(yǎng)6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.3 溫度對菌株酯化力的影響 固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,分別在24、26、28、30、32 ℃條件下培養(yǎng)6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.4 培養(yǎng)時間對菌株酯化力的影響 固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下分別培養(yǎng)4、5、6、7、8 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.5 稻殼添加量對菌株酯化力的影響 分別添加0、4%、8%、12%、16%的稻殼至固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下培養(yǎng)6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件 在單因素實驗的基礎(chǔ)上選取接種量(A)、含水量(B)、培養(yǎng)時間(C)3對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶影響顯著的為自變量,以酯化酶活力為響應(yīng)值(Y)利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗,試驗因素與水平見表1,確定最優(yōu)的固態(tài)發(fā)酵條件并進(jìn)行試驗驗證[28]。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0.6和Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌株酯化酶活力測定

對三株初始紅曲菌酯化酶活力的測定,結(jié)果見表2。

表2 三株初始紅曲菌酯化酶活力Table 2 3 strains of initial Monascus esterification

由表2可知,N3紅曲菌的酶活力相對較高,為19.76 U/g。以該菌株作為出發(fā)菌株,進(jìn)行復(fù)合誘變選育高產(chǎn)酯化酶的紅曲菌菌株。

2.2 UV-ARTP復(fù)合誘變

2.2.1 UV-ARTP分別誘變紅曲菌 UV-ARTP分別誘變紅曲菌致死率與時間的關(guān)系見圖1。

圖1 UV-ARTP分別誘變菌株致死率與時間的關(guān)系Fig.1 Relationship between lethality and time of UV-ARTP mutagenic strains注:a為UV誘變，b為ARTP誘變。

由圖1可以看出,隨著誘變時間的延長,菌株致死率在上升。當(dāng)UV誘變時間為90 s時致死率為87.35%;當(dāng)ARTP誘變時間為50 s時致死率為81.42%。一般認(rèn)為致死率在80%～90%效果好且有利于正突變型菌株的產(chǎn)生,因此選擇UV處理90 s及ARTP處理50 s為最佳誘變時間。

2.2.2 UV-ARTP復(fù)合誘變紅曲菌 采用最佳誘變時間對紅曲菌進(jìn)行復(fù)合誘變,以菌株N3作為出發(fā)菌株,經(jīng)過UV處理90 s后涂布于篩選培養(yǎng)基上,暗條件下28 ℃培養(yǎng)6 d,從中挑選出一株D/d值最大的突變菌株Y4再經(jīng)ARTP處理50 s,稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)6 d。對45株突變株測定其D/d值以及酯化酶活力,部分菌株測定結(jié)果見表3。

表3 UV-ARTP復(fù)合誘變結(jié)果Table 3 UV-ARTP complex mutagenesis results

由表3可知,UV-ARTP復(fù)合誘變對提高紅曲菌產(chǎn)酯化酶活力效果較顯著。其中突變菌株Z14酯化酶活力最高，為44.90 U/g。

2.3 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗

對Z14進(jìn)行連續(xù)傳代,測定其酯化酶活力,見圖2。

圖2 突變菌株Z14的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of mutant strain Z14

由圖2可知,Z14經(jīng)過連續(xù)傳代5次中,產(chǎn)酯化酶活力呈現(xiàn)先降低后趨于穩(wěn)定的趨勢,穩(wěn)定后Z14酯化酶活力為34.44 U/g,較出發(fā)菌株提高了74%。此時，Z14遺傳性能比較穩(wěn)定,可選擇該菌株作為繼續(xù)研究的菌株。

2.4 單因素實驗結(jié)果

2.4.1 接種量對菌株酯化力的影響 接種量對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活力的影響見圖3。隨著接種量的增加,菌株產(chǎn)酯化酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當(dāng)接種量為5%時酯化酶活力最高,為33.98 U/g。接種量過大,營養(yǎng)、溶解氧等不能滿足菌體的生長需要,產(chǎn)酯化酶活力下降。因此接種量5%為菌株培養(yǎng)基最適的接種量。響應(yīng)面試驗接種量選取的水平為:4%、5%、6%。

圖3 不同接種量對菌株酯化力的影響Fig.3 Effect of different inoculation rates on the esterification power of the strain

2.4.2 含水量對菌株酯化力的影響 培養(yǎng)基含水量對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活力的影響見圖4。隨著固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中水分的增加,菌株產(chǎn)酯化酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當(dāng)含水量為70%時產(chǎn)酯化酶活力最高,為34.66 U/g。培養(yǎng)基水分含量過低,不利于菌株生長和發(fā)酵產(chǎn)酶;過高則導(dǎo)致培養(yǎng)基結(jié)塊,不能充分散熱和通氧,也不利于酶活力的積累。因此含水量70%為菌株培養(yǎng)基最適的含水量。響應(yīng)面試驗含水量選取的水平為:65%、70%、75%。

圖4 不同含水量對菌株酯化力的影響Fig.4 Effect of different water contents on the esterification power of the strains

2.4.3 溫度對菌株酯化力的影響 培養(yǎng)溫度對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活力的影響見圖5。隨著培養(yǎng)溫度的升高,菌株產(chǎn)酯化酶活力呈現(xiàn)先升高增加后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時產(chǎn)酯化酶活力最高,為36.01 U/g。培養(yǎng)溫度過高,菌株生長受到抑制,同時也會使酶較快失活,不利于產(chǎn)酶及酶活力的積累。因此28 ℃為菌株最適的培養(yǎng)溫度。

圖5 不同溫度對菌株酯化力的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the esterification power of the strain

2.4.4 培養(yǎng)時間對菌株酯化力的影響 培養(yǎng)時間對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活性的影響見圖6。隨著培養(yǎng)時間的增加,菌株產(chǎn)酯化酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。培養(yǎng)時間為7 d時產(chǎn)酯化酶活力最高,達(dá)到33.44 U/g。隨著培養(yǎng)時間延長,后期會產(chǎn)生一些有害代謝產(chǎn)物,不利于菌種的生長和代謝。因此7 d為菌株最適的培養(yǎng)時間。響應(yīng)面試驗培養(yǎng)時間選取的水平為:6、7、8 d。

表5 響應(yīng)面回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression equation

2.4.5 稻殼添加量對菌株酯化力的影響 稻殼添加量對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活性的影響見圖7。隨著稻殼添加量的增加,菌株產(chǎn)酯化酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)?shù)練ぬ砑恿繛?%時產(chǎn)酯化酶活力最高,為31.76 U/g。稻殼添加量過多,培養(yǎng)基疏松度越大,碳源、氮源含量降低,不利于菌體的生長及發(fā)酵產(chǎn)酶。因此稻殼添加量4%為菌株最適的稻殼添加量。

圖7 不同稻殼添加量對菌株酯化力的影響Fig.7 Effect of different rice husk additions on the esterification power of the strains

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.5.1 Box-Behnken試驗結(jié)果 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Box-Behnken test design and results

圖8 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction of various factors

2.5.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表4的實驗結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合,回歸方程的方差分析結(jié)果見表5。

由表5可知,回歸模型F值為34.64,且顯著性檢驗為極顯著(P<0.0001),失擬項不顯著(P=0.3611>0.05),可知該模型可靠。

2.5.3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖 利用Design-Expert 8.0.6軟件對二次響應(yīng)面回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面。由回歸模型繪制的響應(yīng)面圖,見圖8所示。

響應(yīng)曲面圖可以直觀的反映出兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖8可知,接種量和含水量、接種量和培養(yǎng)時間、含水量和培養(yǎng)時間三種交互組合的響應(yīng)面等高線排列稀疏,說明此三種交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。

2.5.4 最佳發(fā)酵條件的確定及驗證 從上述回歸模型中求得最佳固態(tài)發(fā)酵條件為:接種量為5.09%、含水量為70.31%、培養(yǎng)時間為7.31 d。此條件下,模型預(yù)測值酯化酶活力為37.70 U/g?？紤]到實際情況,調(diào)整條件為:接種量為5%、含水量為70%、培養(yǎng)時間為7 d進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果表明,在最佳發(fā)酵條件下酶活力達(dá)38.53 U/g,與預(yù)測值基本接近,說明所建模型擬合良好且可靠。經(jīng)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件后,菌株產(chǎn)酯化酶水平明顯提高,較出發(fā)菌株提高了95%。

3 討論與結(jié)論

本試驗采用UV-ARTP復(fù)合誘變手段對紅曲菌進(jìn)行誘變育種,通過酯化酶透明圈法初篩和氣相色譜法測酯化酶活力復(fù)篩,選育出1株產(chǎn)酯化酶活力提高較大的紅曲菌Z14,經(jīng)連續(xù)傳代其酯化酶活力穩(wěn)定至34.44 U/g,較出發(fā)菌株提高了74%。通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化得到其最佳固態(tài)發(fā)酵條件為:接種量為5%、含水量為70%、培養(yǎng)時間為7 d。在此條件下其產(chǎn)酯化酶活力達(dá)到38.53 U/g,較出發(fā)菌株提高了95%。

研究表明,ARTP誘變技術(shù)能夠高效快速使微生物發(fā)生突變。蔣汶等[29]采用UV-ARTP復(fù)合誘變方法對紅曲霉ZL307進(jìn)行誘變,多糖產(chǎn)量與原始菌株相比提高了61.18%。方春玉等[30]對紅曲霉菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外線和超聲波的復(fù)合誘變,經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后酯化力與出發(fā)菌株相比提高了83.2%。本實驗以紅曲菌N3為出發(fā)菌株進(jìn)行UV-ARTP復(fù)合誘變,并優(yōu)化了其固態(tài)發(fā)酵條件與出發(fā)菌株相比酯化酶活力有較大提高。

關(guān)于紅曲菌誘變育種的研究較多,但對高酯化力紅曲菌進(jìn)行復(fù)合誘變并優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶條件的研究尚未見報道。本研究采用復(fù)合誘變手段獲得高酯化力紅曲菌突變株并利用響應(yīng)面法對其產(chǎn)酯化酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。為酯化型紅曲菌用于濃香型白酒的生產(chǎn),提升白酒質(zhì)量和提高優(yōu)級酒產(chǎn)率,奠定理論研究基礎(chǔ)和優(yōu)質(zhì)菌種來源。