孫 宏,李婷婷,宋敏杰,趙貴琴,勵(lì)建榮,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121013; 2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

大菱鲆,英文Turbot音譯而成,即歐洲比目魚,在中國(guó)稱之為“多寶魚”,主要分布在大西洋東側(cè)歐洲沿岸等地,被國(guó)際認(rèn)為是高價(jià)值的食用魚類[1]。我國(guó)現(xiàn)有渤海、黃海、東海和南海四大海區(qū)漁場(chǎng),遼寧省作為我國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖第一大省,養(yǎng)殖年產(chǎn)量達(dá)到2.2 萬(wàn)噸,占全國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖面積的一半左右[2]。

大菱鲆含有豐富的高營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、Ω-3脂肪酸和DNA[3],符合消費(fèi)者對(duì)深海水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)的需求。每天食用200 g的大菱鲆魚,就可以滿足一個(gè)成年人一天所需蛋白質(zhì)含量的一半以上[4]。人體血尿酸正常含量為200～410 umol/L[5],Kaneko根據(jù)嘌呤含量的多少將食物分為極低、低、中度、高和極高嘌呤食物五個(gè)等級(jí),極低組:<50 mg/100 g,低組:50～100 mg/100 g,中度組:100～200 mg/100 g,高組:200～300 mg/100 g,極高組:>300 mg/100 g[6]。其中極低嘌呤食物包括谷類、蔬菜、雞蛋以及乳制品,低嘌呤食物包括菌菇和部分加工肉,中等嘌呤含量的食物包括部分肉制品及大部分水產(chǎn)品,而大菱鲆中所含嘌呤含量高達(dá)111.94 mg/100 g[7]。對(duì)于嘌呤脫除的食物主要集中在啤酒[8-9]及豆制品[10-11]中,而對(duì)于畜禽水產(chǎn)品中嘌呤的脫除主要是通過(guò)簡(jiǎn)單地加工[12-13]進(jìn)行。呂兵兵[14]對(duì)帶魚分別進(jìn)行水煮、清蒸和油炸加工處理,實(shí)驗(yàn)表明,水煮處理可以有效脫除嘌呤。任麗琨[15]通過(guò)對(duì)大菱鲆進(jìn)行香辛調(diào)味料(大蒜粉、生姜粉、花椒粉、桂皮茴香)溶液浸泡處理,研究表明,這五種調(diào)味料均可有效脫除嘌呤,且大蒜粉、花椒粉、生姜粉浸泡處理的魚肉嘌呤脫除效果最佳,并對(duì)大菱鲆進(jìn)行大蒜素浸泡-水煮處理,研究表明,大菱鲆魚片經(jīng)大蒜素浸泡,清水水煮處理,嘌呤脫除率高達(dá)70%。因此通過(guò)浸泡-水煮處理,脫除嘌呤,開(kāi)發(fā)獨(dú)具特色的功能性調(diào)理水產(chǎn)品,可以提高產(chǎn)品受眾范圍,能夠有效促進(jìn)水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)朝著健康的方向發(fā)展。

鑒于目前對(duì)于水產(chǎn)品中嘌呤檢測(cè)的方法沒(méi)有明確的統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),常用的方法包括色譜、電泳以及離子交換法。其中高效液相色譜因其高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn),使用最為廣泛。因此本文基于高效液相色譜法,通過(guò)外源添加花椒粉浸泡魚片并結(jié)合水煮處理的方法,對(duì)處理前后的樣品嘌呤含量進(jìn)行了檢測(cè),以制備低嘌呤調(diào)理魚片。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活大菱鲆(Scophthalmusmaximus) 遼寧省錦州市林西市場(chǎng),每條凈重750～1000 g?；ń贩?Zanthoxylumbungeanum) 中國(guó)吉林省杞參食品有限公司;腺嘌呤(Adenine)、鳥(niǎo)嘌呤(Guanine)、次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)、四丁基氫氧化氨(10%于純水中)、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、冰乙酸(Glacial acetic acid) 均為色譜純,純度≥99.0%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超純水(Milli-Q Ultra-pure water) 美國(guó)Millipore公司;甲酸(Formic acid,FAC) 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑有限公司。

SK6210HP型超聲清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;JYL-C012型絞肉機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;DK-BD型電熱恒溫水槽 上海恒一科技有限公司;MS105DU型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司;LC-2030型島津高效液相色譜儀 日本島津;Biofuge Stratos型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 嘌呤含量的測(cè)定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考宋敏杰等[16]的方法稍作調(diào)整,分別稱取0.0120 g腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤定容至10 mL,配置成濃度為1200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mol/L的NaOH助溶)備用。隨后用超純水將四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋配制成300、200、100、50、5、0.5、0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。所有待測(cè)樣品過(guò)0.22 μm濾膜,在選定的色譜條件下進(jìn)行嘌呤含量測(cè)定,得到峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)做線性回歸方程。

1.2.2 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C18Plus(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速0.6 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量6.0 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。將冰乙酸、四丁基氫氧化銨、超純水按體積比1.5∶1.5∶997混合作為流動(dòng)相a,再與甲醇(流動(dòng)相b)按95∶5混合作為最終流動(dòng)相。

1.2.3 樣品處理和測(cè)定 采用Qu等[17]測(cè)定嘌呤的方法,稍作修改。稱取0.20 g樣品置于50 mL離心管中。加入三氟乙酸及甲酸各10 mL,混合后90 ℃水浴加熱12 min,然后置于80 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,殘余物用流動(dòng)相A復(fù)溶,取復(fù)溶后的液體過(guò)0.22 μm濾器后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 方法學(xué)考察 在此進(jìn)一步通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的方式探究其在本實(shí)驗(yàn)中的可行性。方法精密度:利用已確定的色譜方法對(duì)同一混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量為6 μL,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),確定高效液相色譜方法的精密度(RSD)。重復(fù)性驗(yàn)證:取四種嘌呤的單一儲(chǔ)備液,各自連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,計(jì)算四種嘌呤物質(zhì)各自的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),確定儀器精密度。

1.3 預(yù)制調(diào)理低嘌呤大菱鲆魚片的制備

1.3.1 工藝流程 在傳統(tǒng)調(diào)理魚片加工工藝[16]的基礎(chǔ)上,增加嘌呤脫除工藝,制得預(yù)制低嘌呤調(diào)理魚片。低嘌呤大菱鲆調(diào)理魚片加工工藝流程:魚→取背部魚肉→脫除嘌呤→調(diào)味→包裝→儲(chǔ)藏。

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 魚片的前處理 將鮮活的大菱鲆運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用碎冰猝死,去除內(nèi)臟,沿椎骨剖開(kāi)取背部魚片,用水沖洗干凈,瀝水,取魚背部肌肉,并切成體積大小為6 cm×3 cm×2 cm規(guī)格的魚片[18]。

1.3.2.2 嘌呤脫除與加工 通過(guò)在添加有一定量的花椒粉溶液中浸泡一定時(shí)間后取出魚肉,移至沸水中水煮一定時(shí)間,對(duì)魚肉中的嘌呤含量進(jìn)行脫除。

1.3.2.3 調(diào)味、包裝、儲(chǔ)藏 加入食鹽2.5%,蔗糖1.5%,蔥汁1.5%,蒜汁1.5%,香菜汁1.5%,料酒4.0%,制得調(diào)味液[19]。均勻的涂抹在加工過(guò)的魚片上,真空包裝[20],4 ℃冷藏貯藏。

1.3.3 花椒粉溶液浸泡對(duì)大菱鲆嘌呤含量影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,浸泡溫度對(duì)嘌呤的影響較小,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在25 ℃條件下進(jìn)行。

1.3.3.1 浸泡時(shí)間的選擇 將20.00 g的樣品(背部魚肉)于2%的花椒粉水溶液中分別浸泡0、15、30、45、60 min,測(cè)定嘌呤含量。

1.3.3.2 花椒粉添加量的選擇 將20.00 g的樣品(背部魚肉)于0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的花椒粉水溶液中浸泡20 min,測(cè)定嘌呤含量。清水浸泡為對(duì)照。

1.3.4 花椒粉水溶液水煮對(duì)大菱鲆嘌呤含量影響

1.3.4.1 生熟肉轉(zhuǎn)化系數(shù)的確定 經(jīng)水煮加工的水產(chǎn)品,組織中的汁液易流出,從而質(zhì)量減小,以致于影響嘌呤含量的準(zhǔn)確性,引起誤差[21-22],為此,采用王新宴等[21]的方法計(jì)算生熟肉轉(zhuǎn)化系數(shù),減少誤差。將20.00 g普通魚肉在清水中煮0、2、4、6、8、10、12、14 min。稱量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)熟肉質(zhì)量,計(jì)算生熟肉轉(zhuǎn)換系數(shù)(F)[24],計(jì)算公式如下:

F=熟肉質(zhì)量/生肉質(zhì)量

熟肉中嘌呤含量=樣品中嘌呤含量×轉(zhuǎn)換系數(shù)

1.3.4.2 水煮時(shí)間對(duì)大菱鲆嘌呤含量影響 將2%的花椒粉加入到200 mL水中至沸騰，取20.00 g未浸泡魚肉置于沸水中繼續(xù)加熱,并于0、2、4、6、8、10、12、14 min時(shí)對(duì)大菱鲆進(jìn)行感官評(píng)分并測(cè)定嘌呤含量。

以清水為對(duì)照組,在200 mL水沸騰時(shí)，取20.00 g未浸泡魚肉置于沸水中繼續(xù)加熱,并于0、2、4、6、8、10、12、14 min時(shí)測(cè)定嘌呤含量[25]。

1.3.4.3 感官評(píng)定 對(duì)魚塊進(jìn)行浸泡、水煮處理之后,借用五名經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的感官評(píng)價(jià)員,采用5人評(píng)價(jià)法,對(duì)錫箔紙包裹著的熟魚片從肌肉組織彈性、色澤、氣味的變化、滋味口感得濃郁程度進(jìn)行感官評(píng)價(jià),感官評(píng)價(jià)表如表1所示。

表1 水煮時(shí)間對(duì)大菱鲆感官的影響Table 4 Effect of boiling time on the sensory sense of turbot

1.3.5 浸泡-水煮處理對(duì)嘌呤含量的影響 將20.00 g魚肉在2%的花椒粉溶液中浸泡45 min后,置于清水中煮8 min,測(cè)其嘌呤含量。

1.3.6 嘌呤脫除率的計(jì)算

嘌呤脫除率(%)=(a-b)/a

式中:a:未經(jīng)處理樣品中嘌呤含量,g;b:花椒粉浸泡并清水水煮處理后樣品嘌呤含量,g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,數(shù)據(jù)處理使用軟件Excel 2007和SPSS 17.0,繪圖采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘌呤含量的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由表2可知,該方法在0.1～300 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,決定系數(shù)(R2)均大于0.999。符合實(shí)驗(yàn)要求。

表2 嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of purine

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The precision results

2.1.2 方法學(xué)驗(yàn)證 由于檢測(cè)儀器的型號(hào)、廠家等客觀因素能夠?qū)︵堰蕶z測(cè)的準(zhǔn)確性造成一定的影響,因此進(jìn)一步通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的方式對(duì)所采用的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)同一混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,結(jié)果如表3所示,四種嘌呤物質(zhì)測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.1199%～0.4393%,表明儀器精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表4),四種嘌呤的峰面積的RSD分別為4.2983%、4.3827%、2.1970%、4.3859%,該方法重復(fù)性良好(RSD<5%),適用于嘌呤檢測(cè)。

2.2 嘌呤的脫除

2.2.1 花椒粉溶液浸泡對(duì)大菱鲆嘌呤含量影響

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 4 Repeatability test

表5 浸泡時(shí)間對(duì)各嘌呤含量的影響Table 5 Effect of soaking time on the content of each purine

表6 花椒粉添加量對(duì)各嘌呤含量的影響(mg/100 g)Table 6 Effect of Pepper powder addition on the content of each purine(mg/100 g)

2.2.1.1 浸泡時(shí)間的確定 表5為不同浸泡時(shí)間對(duì)大菱鲆嘌呤含量的影響,大菱鲆經(jīng)花椒粉水溶液浸泡60 min時(shí),嘌呤含量總體呈下降趨勢(shì)。在0～15 min內(nèi),三種嘌呤均迅速減少,腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤分別減少33.3148、7.7079、9.3622 mg/100 g。15 min以后,嘌呤減少速度逐漸緩慢,最后趨于穩(wěn)定,結(jié)果與任麗琨[15]一致。且在15 min時(shí)嘌呤總含量減少了50.9448 mg/100 g,嘌呤脫除率達(dá)到60.47%,45 min時(shí)嘌呤含量最低,因此選擇45 min為最佳浸泡時(shí)間。新鮮的大菱鲆中未檢測(cè)到黃嘌呤,可能是因?yàn)楸巢眶~肉中黃嘌呤含量本來(lái)就少,且黃嘌呤易溶于水[26]。

2.2.1.2 花椒粉添加量的確定 表6為不同花椒粉添加量對(duì)大菱鲆嘌呤含量的影響,隨著花椒粉添加量的增加,嘌呤含量總體呈現(xiàn)先下降后緩慢升高的趨勢(shì),腺嘌呤、次黃嘌呤均是如此,黃嘌呤因其含量較低仍然無(wú)法檢出,其中腺嘌呤和次黃嘌呤變化最為顯著,在花椒粉添加量達(dá)到2.0% 時(shí),嘌呤總含量達(dá)到最低為42.3889 mg/100 g,嘌呤脫除率達(dá)到32.14%,推測(cè)可能與花椒粉中的某些活性成分有關(guān)[27]。之后嘌呤總含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì),進(jìn)行顯著性分析,表明1.5%、2.0%、2.5%、3.0%之間的嘌呤含量差異不顯著。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇2.0%的花椒粉為最佳添加量。

2.2.2 水煮時(shí)間對(duì)大菱鲆嘌呤含量影響

2.2.2.1 生熟肉轉(zhuǎn)化系數(shù)結(jié)果 魚肉在0、2、4、6、8、10、12、14 min時(shí)的轉(zhuǎn)化系數(shù)分別為 1.000、0.939、0.857、0.802、0.771、0.746、0.730、0.707。隨著水煮時(shí)間的增長(zhǎng),汁液流出,肌肉組織斷裂損失,所以質(zhì)量越來(lái)越小。

2.2.2.2 水煮時(shí)間對(duì)大菱鲆感官得分的影響 圖1為水煮過(guò)程中大菱鲆的感官得分,隨著水煮時(shí)間的增加,大菱鲆魚腥味逐漸減弱,特有的香氣變得越來(lái)越濃郁,生肉感逐漸消失,口感逐漸變得細(xì)膩,因此風(fēng)味、口感得分越來(lái)越高,而肉質(zhì)由于加熱致使肌肉纖維收縮,使得魚肉越來(lái)越?jīng)]有彈性,且逐漸變得不完整[28],外觀得分越來(lái)越低。

圖1 水煮過(guò)程中大菱鲆感官得分Fig.1 Sensory scores of the cooked turbot with boiling

2.2.2.3 水煮時(shí)間對(duì)大菱鲆嘌呤含量影響 圖2為水煮時(shí)間對(duì)嘌呤含量的影響,隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng),嘌呤含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),推測(cè)可能是由于隨著水煮時(shí)間的增加,流動(dòng)水滲入到魚肉組織內(nèi)部對(duì)嘌呤進(jìn)行了稀釋。有研究表明,隨著溫度的增加,魚肉中肌纖維收縮,肌束空隙擴(kuò)大,不易流動(dòng)水向自由水轉(zhuǎn)變,使肌肉組織中的自由水含量增大[29],從而引起嘌呤溶出。

圖2 水煮時(shí)間對(duì)嘌呤含量影響Fig.2 Effects of cooking time on the content of purine

與空白組相比,實(shí)驗(yàn)組嘌呤總含量?jī)H減少6.94%,即單純花椒粉水溶液水煮對(duì)其嘌呤含量的影響不大,說(shuō)明在嘌呤脫除過(guò)程中各工序存在協(xié)同作用。推測(cè)可能是因?yàn)樵谒蠹庸み^(guò)程中嘌呤的變化主要由熱萃取作用引起。且次黃嘌呤相對(duì)較容易溶于湯中,腺嘌呤次之,鳥(niǎo)嘌呤最難[30]。

結(jié)合圖1水煮過(guò)程中大菱鲆感官得分以及圖2水煮時(shí)間對(duì)嘌呤含量的影響,最終選擇水煮加工的最佳時(shí)間為8 min。

2.2.3 浸泡-水煮處理對(duì)嘌呤含量的影響 圖3為浸泡-水煮對(duì)嘌呤含量的影響,與新鮮大菱鲆相比,利用清水對(duì)大菱鲆進(jìn)行浸泡并且加熱煮沸處理,能夠使嘌呤含量減少58.07%；而以花椒粉對(duì)大菱鲆進(jìn)行浸泡加熱處理,與新鮮大菱鲆相比嘌呤總含量減少了79.50%,與清水浸泡-清水水煮過(guò)的空白組相比嘌呤含量降低了21.43%,推測(cè)可能是因?yàn)轸~肉中含較多的次黃嘌呤,而花椒粉中的有效成分可促進(jìn)黃嘌呤氧化酶的活性,進(jìn)而使次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,黃嘌呤易溶于熱水[31],從而脫除嘌呤。由此可知,通過(guò)花椒粉浸泡-清水水煮的方式加工處理可以顯著降低大菱鲆中的嘌呤含量。進(jìn)而制得本文中預(yù)制低嘌呤魚片。

圖3 浸泡-水煮對(duì)嘌呤含量的影響Fig.3 Effect of soaking-boiled on the content of purine注:不同小寫字母代表同一指標(biāo) 不同組之間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以高效液相色譜法為檢測(cè)方法,通過(guò)用天然香辛料花椒粉溶液浸泡-清水水煮魚片的方式,脫除魚片中的嘌呤,結(jié)果顯示通過(guò)用2%的花椒粉浸泡魚片45 min,再用清水煮沸8 min,可得到低嘌呤調(diào)理魚片。與清水浸泡-清水水煮過(guò)的空白組相比嘌呤含量降低了21.43%,基于此,花椒粉浸泡結(jié)合清水水煮的加工方式可有效脫除嘌呤,實(shí)驗(yàn)所研制的魚片,提高了感官品質(zhì),拓寬了產(chǎn)品受眾范圍,進(jìn)一步促進(jìn)水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。由于花椒粉成分復(fù)雜,花椒粉對(duì)嘌呤的脫除機(jī)理鮮有報(bào)道,起到主要作用的成分還有待進(jìn)一步研究。后續(xù)可以嘗試通過(guò)虛擬篩選、分子對(duì)接等現(xiàn)代化手段探究花椒粉中嘌呤相關(guān)的活性成分以及作用方式。