郝淑文 陳 瑛 丁 暉 趙春松,6 梁 闊,6 薛金花,6 蔡彥寧,6*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100053；2.教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053; 3.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 北京 100053; 4.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100053；5.浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 浙江臺(tái)州 318000；6.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院生物樣本庫，北京 100053)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),以記憶和認(rèn)知功能進(jìn)行性下降為特征，是最常見的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病[1]。遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙(amnestic mild cognitive impairment, aMCI),以嚴(yán)重的情景記憶喪失為特征，通常認(rèn)為是AD的前驅(qū)期(癡呆前期)[2-3]。主觀認(rèn)知下降(subjective cognitive decline, SCD)，指?jìng)€(gè)體主觀感覺自身認(rèn)知功能一方面或者多方面持續(xù)減退，在AD的持續(xù)發(fā)展過程中，出現(xiàn)在aMCI之前[4]。SCD的診斷主要基于個(gè)體主觀感受的認(rèn)知能力下降和一組神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試[1]。因此，需要客觀的SCD生物標(biāo)志物幫助醫(yī)生更容易和可靠地鑒定SCD患者，以便為他們提供早期有效的治療。

DNA甲基化是參與基因表達(dá)調(diào)控的最重要的表觀遺傳修飾之一。AD腦組織存在DNA甲基化變化，并與AD病理變化密切相關(guān)。針對(duì)AD和MCI患者外周血的研究[5-12]也表明DNA甲基化變化可以用于疾病的早期預(yù)警、診斷及鑒別診斷。D’Addario等[7]的研究顯示，AD患者外周血脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase,FAAH)基因甲基化水平降低；Di Francesco等[8]的研究顯示AD患者外周血花生四烯酸 5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX5)基因甲基化水平降低；Lunnon等[9]在出現(xiàn)癡呆癥狀前的老年2型糖尿病患者中鑒定了大量CpG位點(diǎn)，包括CBFA2/RUNX1伴侶轉(zhuǎn)錄共抑制因子3(CBFA2/RUNX1 partner transcriptional co-repressor 3,CBFA2T3)和堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員E23 (basic helix-loop-helix family member e23,BHLHE23)的上游兩個(gè)位點(diǎn)。但是，上述甲基化研究都是在白種人中進(jìn)行，并未在中國人群進(jìn)行驗(yàn)證，并且很少研究SCD患者。因此，筆者設(shè)計(jì)了該病例對(duì)照研究，探索中國人群中可用于SCD客觀診斷的外周血生物標(biāo)志物。

本研究針對(duì)既往報(bào)道[7-9]的4種AD和/或aMCI階段DNA甲基化標(biāo)志物，并且采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序的方法評(píng)估其在AD、aMCI、SCD和對(duì)照受試者中的甲基化水平。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年12月到2017年9月從首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科記憶門診招募AD患者31例、aMCI患者41例、SCD患者57例和當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)健康對(duì)照57人為研究對(duì)象。本研究得到宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[臨研審(2014)011號(hào)]，符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)道德守則(赫爾辛基宣言)的規(guī)定，每位研究對(duì)象獲得知情同意。

AD患者滿足美國國立神經(jīng)病、語言功能紊亂和腦卒中研究所及AD和相關(guān)疾病協(xié)會(huì) (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association, NINCDS-ADRDA)可能癡呆的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。aMCI患者根據(jù)Petersen標(biāo)準(zhǔn)[14]進(jìn)行診斷。SCD患者滿足最近提出的SCD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。健康對(duì)照無記憶和智能障礙，并且其臨床癡呆評(píng)估量表(Clinical Dementia Rating, CDR)評(píng)分為0。如果受試者有以下一個(gè)或多個(gè)臨床特征將排除：①明確的卒中史;②嚴(yán)重抑郁[漢密爾頓抑郁量表評(píng)分(Hamilton Depression Rating Scale, HAMD)>24分];③由創(chuàng)傷性腦外傷導(dǎo)致認(rèn)知受損;④其他和認(rèn)知受損相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如腦腫瘤、帕金森病、腦炎和癲癇;⑤其他可以導(dǎo)致認(rèn)知受損的系統(tǒng)疾病，例如甲狀腺功能障礙、嚴(yán)重貧血、梅毒和艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS);⑥精神病史或者先天性智力發(fā)育遲緩。所有參與者都進(jìn)行了簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)評(píng)估。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基化候選基因的挑選

ALOX5和FAAH基因甲基化水平的失調(diào)，其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也失調(diào)[7-8]，此外，在出現(xiàn)癡呆癥狀前的老年2型糖尿病患者中鑒定了大量CpG位點(diǎn)，包括CBFA2T3和BHLHE23基因上游兩個(gè)位點(diǎn)[9]。因此本研究中共檢驗(yàn)了4個(gè)候選基因：FAAH、ALOX5、CBFA2T3和BHLHE23。

1.2.2 焦磷酸測(cè)序分析

早晨6:00到8:00收集靜脈血樣。QIAamp DNA mini 試劑盒(德國Qiagen公司)抽提白細(xì)胞基因組DNA,并進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理[15]。對(duì)于亞硫酸氫鹽反應(yīng)(其中胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶保持不變)，基因組DNA的最初變性使用0.3 mol/L NaOH，再加入偏亞硫酸氫鈉(pH 5.0)和對(duì)苯二酚使終濃度分別為3.0 mol/L和0.5 mmol/L。反應(yīng)混合物上加礦物油，避光，于50 ℃孵育16 h。變性的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化(美國Promega公司)，后用0.3 mol/L NaOH 在37 ℃處理15 min終止反應(yīng)，乙醇沉淀。對(duì)于亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序分析，50 ng亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA應(yīng)用HS Taq(日本Takara公司)進(jìn)行擴(kuò)增。4個(gè)靶基因的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增引物及測(cè)序引物的序列如表1所示。CBFA2T3的上游引物在5′端包含生物素，而其他三個(gè)基因的下游引物在5′端包含生物素。ALOX5的擴(kuò)增條件如下:94 ℃預(yù)變性 2 min;94 ℃變性20 s,61 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。FAAH、CBFA2T3和BHLHE23的擴(kuò)增條件如下： 94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 變性20 s,64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。對(duì)于焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，使用PSQ真空預(yù)處理裝置(德國Qiagen公司)將單鏈DNA模板固定在鏈霉親和素標(biāo)記的Sepharose高性能微珠(瑞典GE Healthcare公司) 上。反應(yīng)物在80 ℃孵育2 min，冷卻至室溫，使用0.4 mmol/L測(cè)序引物，使用Pyromark Q96 焦磷酸測(cè)序儀和測(cè)序試劑盒(德國Qiagen公司)，按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

表1 用于定量4個(gè)不同基因甲基化水平的焦磷酸測(cè)序分析的引物

1.2.3 基因分型

載脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)ε2/ε3/ε4單倍型的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNPs) rs7412 和 rs429358。使用標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序方法對(duì)APOE進(jìn)行基因分型，使用引物如下：5′-ACGCGGGCACGGCTGTCCAAGG-3′(上游)和5′-GGCGCTCGCGGATGGCGCTGA-3′(下游)。APOE擴(kuò)增條件如下：98 ℃ 10 s；72 ℃ 5 s，共35循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR在終體積30 μL的溶液中進(jìn)行，包含10 pmol上游和下游引物，50 ng基因組DNA模板，并使用有GC緩沖液的PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (日本Takara公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組研究對(duì)象的基本特征

4組間性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 AD組患者年齡大于aMCI、SCD、對(duì)照組，MMSE評(píng)分低于其他組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APOEε4等位基因的攜帶者頻率AD組最高，其次是aMCI組，健康對(duì)照組最低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 研究對(duì)象的基本特征

2.2 各組FAAH, ALOX5, CBFA2T3和BHLHE23基因甲基化水平比較

4個(gè)基因的甲基化水平在各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。根據(jù)性別的分層分析，男性中FAAH:P=0.234,ALOX5:P=0.865,CBFA2T3:P=0.109,BHLHE23:P=0.502;女性中FAAH:P=0.337,ALOX5:P=0.250,CBFA2T3:P=0.624,BHLHE23:P=0.355，分層后各組間4個(gè)基因的甲基化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)APOE基因型分層分析，APOEε4非攜帶者中FAAH:P=0.293,ALOX5:P=0.335,CBFA2T3:P=0.364,BHLHE23:P=0.395；APOEε4攜帶者中FAAH:P=0.347,ALOX5:P=0.908,CBFA2T3:P=0.898,BHLHE23:P=0.704，分層后各組間4個(gè)基因的甲基化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 AD, aMCI, SCD和對(duì)照組血液DNA中4個(gè)靶基因的甲基化水平

3 討論

由于SCD的診斷主要依靠患者主觀感覺認(rèn)知能力下降和神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試，缺乏客觀的診斷生物標(biāo)志物，早期診斷對(duì)于患者治療具有重要意義。因此，在本研究中筆者假設(shè)AD和/或aMCI的診斷生物標(biāo)志物可能也有潛力作為SCD的生物標(biāo)志物。為了檢測(cè)這一假設(shè)，挑選了4個(gè)之前報(bào)道[7-9]的AD和/或aMCI差異甲基化的基因，并評(píng)估了它們?cè)贏D、aMCI、SCD和對(duì)照受試者中的甲基化水平。發(fā)現(xiàn)4個(gè)候選基因中沒有一個(gè)在SCD患者中是差異甲基化的。這表明在AD的晚期或中期鑒定的DNA甲基化變化不總是適用于SCD的生物標(biāo)志物。

FAAH是終止內(nèi)源性大麻素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶之一，它能夠水解花生四烯酸乙醇胺(arachidonic acid ethanolamine, AEA)和其他脂肪酸酰胺。FAAH參與AD的炎性反應(yīng)過程及花生四烯酸等促炎分子的釋放[16]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)是花生四烯酸生成白三烯類介質(zhì)(leukotrienes, LTs)的限速酶，由5-LOX合成的白三烯參與和年齡相關(guān)癡呆及神經(jīng)退行性疾病的大腦炎性反應(yīng)[17-18]。盡管CBFA2T3和BHLHE23與癡呆相關(guān)聯(lián)的可能機(jī)制尚無報(bào)道，但是Lunnon等[9]的研究顯示其甲基化在AD中發(fā)生改變，其差異甲基化可能成為早期認(rèn)知改變的潛在生物標(biāo)志物。

本研究選取的4個(gè)基因分析甲基化水平，其甲基化值分布在較低(FAAH、ALOX5:<10%)、中等(CBFA2T3: 20%～30%)和較高(BHLHE23: 80%～90%)，這種設(shè)計(jì)可對(duì)AD、MCI及SCD人群的甲基化研究有比較全面的了解，從不同的基因、不同的甲基化水平探討可能的疾病生物標(biāo)志物。

本研究未在AD和/或aMCI患者與正常對(duì)照之間檢驗(yàn)出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的甲基化，可能有以下原因。首先，應(yīng)該注意到FAAH、ALOX5、CBFA2T3和BHLHE23的差異甲基化在白種人中鑒定，而本研究中招募的受試者是中國人。種族的差異可能會(huì)導(dǎo)致不一致的研究結(jié)果。實(shí)際上，已經(jīng)有研究[19]顯示伴神經(jīng)母細(xì)胞瘤的德國和日本患者之間同源盒A9(homeobox A9，HOXA9)基因啟動(dòng)子甲基化水平的差異。此外，在印度亞洲人之間代表4個(gè)位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的甲基化評(píng)分顯著高于歐洲人[20]。這些研究結(jié)果表明當(dāng)選擇潛在的甲基化生物標(biāo)志物用于驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)該考慮種族的差異。其次，之前FAAH及ALOX5基因的研究[7-9]中采用外周血單核細(xì)胞，本研究中采用外周血白細(xì)胞。從全血中提取的DNA甲基化由不同類型血液有核細(xì)胞混合的DNA甲基化構(gòu)成[21]。全血DNA甲基化研究[22]中不同血細(xì)胞類型分布可能作為混雜因素。本研究使用全血DNA，血細(xì)胞類型不確定的構(gòu)成可能潛在影響結(jié)果。另外，之前的CBFA2T3和BHLHE23研究受試者是出現(xiàn)癡呆癥狀前的老年2型糖尿病患者。2型糖尿病本身和AD密切相關(guān)[23]，其差異甲基化位點(diǎn)可能在一定程度上受到基礎(chǔ)疾病的影響。最后，還有甲基化檢測(cè)方法不一致，本研究中采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序，而焦磷酸測(cè)序是甲基化定量研究的金標(biāo)準(zhǔn)。之前FAAH的研究[7]采用甲基化特異性引物實(shí)時(shí)PCR，ALOX5研究[8]采用基于熒光的實(shí)時(shí)PCR、CBFA2T3和BHLHE23的研究采用Illumina人甲基化450 K基因芯片技術(shù)。這些條件的不一致可能是本研究和既往研究結(jié)果不同的原因。

雖然本研究并未發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因甲基化水平的差異，但是，這些結(jié)果并不能排除一些人群中的AD關(guān)鍵特異性基因的甲基化改變，當(dāng)前的結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解釋，有必要在更大的病例對(duì)照人群中進(jìn)行該領(lǐng)域的研究，進(jìn)一步確定DNA甲基化在神經(jīng)退行性疾病中的程度和作用。本研究使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)在中國AD患者中進(jìn)行FAAH、ALOX5、CBFA2T3、BHLHE23基因甲基化的研究，為神經(jīng)退行性疾病的早期診斷和治療提供了一定的理論依據(jù)。

總之，本研究表明與健康對(duì)照相比，F(xiàn)AAH、ALOX5、CBFA2T3和BHLHE23四個(gè)基因在AD、aMCI或者SCD患者中未發(fā)現(xiàn)差異甲基化。在AD的晚期或中期鑒定的DNA甲基化變化不總是適用于SCD診斷的生物標(biāo)志物。