唐 俊 孫雪娟 譚 翠

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點實驗室 重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院研究生管理處 重慶 400016)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，是指人為地將外源性基因分子如DNA、RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)的一種技術(shù)。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展及基因與蛋白功能的研究深入，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本實驗方法。目前，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三類途徑：物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)。物理方法包括電穿孔法、顯微注射和基因槍等；化學(xué)介導(dǎo)方法種類較多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)等；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。與其他途徑相比，慢病毒體系作為生物介導(dǎo)的方法之一，因其安全性高、免疫赦免小、可重復(fù)性強、能夠攜帶大基因片段且可長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用[1]。慢病毒包裝中常用的轉(zhuǎn)染試劑有PEI、脂質(zhì)體等。聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，因其可以縮聚DNA分子形成顆粒，常被用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體是磷脂分散在水中形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜，可將DNA分子包裹在內(nèi)形成DNA-脂復(fù)合物，適用于各種懸浮或貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率較高。

本實驗采用兩種轉(zhuǎn)染試劑PEI和LipoD293作為研究對象，將攜帶CMV啟動子和綠色熒光蛋白GFP（green fluorescent protein）標(biāo)記的慢病毒質(zhì)粒包裝成慢病毒液，通過對比觀察包裝及病毒液感染后，293T細(xì)胞中熒光蛋白表達(dá)強弱來比較兩種脂質(zhì)體的慢病毒包裝效果，為慢病毒包裝過程中轉(zhuǎn)染試劑的選擇提供實驗依據(jù)。

一、材料與方法

（一）主要儀器及試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基Dulbecco’s modification of Eagle medium(DMEM)、減血清培養(yǎng)基Opti-MEM、Fetal Bovine Serum (FBS)、胰蛋白酶、高速離心機Micro17均購自美國Thermo Fisher公司，脂質(zhì)體LipoD293購自SignaGen公司，激光共聚焦顯微鏡TCSSP8購自德國Lei Ka公司，PEI購自polysciences公司，將PEI終濃度配置成1mg/ml，置于-20℃保存。

（二）質(zhì)粒

慢病毒質(zhì)粒pLenti-C-mGFP由OriGene公司構(gòu)建，包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2G由南開大學(xué)饋贈。

（三）細(xì)胞株及培養(yǎng)條件

293T細(xì)胞購自ATCC，由實驗室細(xì)胞庫凍存。培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM，置于37℃、CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

（四）慢病毒包裝

1.細(xì)胞傳代及種板

對數(shù)生長期293T細(xì)胞匯合90%時，去除上清，加入2ml PBS，輕輕晃動后去除，加入1ml0.1%胰酶，置于生物安全柜中室溫消化30s，待大部分細(xì)胞變圓后，輕拍瓶底，使細(xì)胞漂浮，加入1ml培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液倒入離心管中，1000r離心5分鐘，棄上清，加入培養(yǎng)基，以1.5*106接種于六孔板，共6孔，每3個孔為一組，分別標(biāo)記A、B兩組，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)80%左右，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.用PEI和LipoD293包裝慢病毒

A組用PEI轉(zhuǎn)染：①250ul Opti-MEM+PEI 7ul混勻后室溫靜置5min；②250ul Opti-MEM+質(zhì)粒4.8ug(psPAX2 1.8ug、pMD2G 0.6ug、pLenti-C-mGFP 2.4ug)混勻后室溫靜置5min；③將②中質(zhì)?；旌弦壕徛尤擘僦校靹蚝笫覝仂o置20min。

B組用LipoD293轉(zhuǎn)染：①250ul Opti-MEM+LipoD293 7.2ul混勻后室溫靜置5min；②250ul Opti-MEM+質(zhì)粒4.8ug(psPAX2 1.8ug、pMD2G 0.6ug、pLenti-C-mGFP 2.4ug)混勻后室溫靜置5min；③將②中質(zhì)?；旌弦壕徛尤擘僦校靹蚝笫覝仂o置20min。

六孔板中細(xì)胞去除原培養(yǎng)基，加入1ml PBS潤洗后去除，沿孔壁緩慢加入500ul Opti-MEM，再加入PEI/LipoD293與質(zhì)粒的混合液，輕柔搖晃混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。A組4小時、B組6h后每孔更換為2ml完全培養(yǎng)基。48小時后，用激光共聚焦顯微鏡觀察每孔中細(xì)胞GFP陽性率并收集病毒液于離心管中，20000r離心20min[2]，A組病毒液標(biāo)記為病毒液A，B組病毒液標(biāo)記為病毒液B，每EP管分裝500ul，測定病毒滴度后，儲存于-80℃

（五）慢病毒液感染293T細(xì)胞

對數(shù)生長期293T細(xì)胞，提前一天按照1.4.1種板及分組。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)60%左右，進(jìn)行感染。

病毒液A、B在4℃冰箱中融化后，A組加入含病毒液A的1/2體積培養(yǎng)基，B組加入含病毒液B的1/2體積培養(yǎng)基，感染16-18h后去除含病毒液上清，加入2ml完全培養(yǎng)基。48小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察每孔中細(xì)胞GFP陽性率。

（六）差異及統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件，進(jìn)行Student t-test檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果與分析

在慢病毒包裝過程中，用PEI（A組）和LipoD293（B組）分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察兩組中細(xì)胞GFP表達(dá)如圖A所示。A組細(xì)胞GFP表達(dá)少于B組。

圖A

用A、B病毒液分別感染293T細(xì)胞48h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察兩組細(xì)胞GFP表達(dá)如圖B顯示。A組細(xì)胞GFP表達(dá)明顯少于B組，即用在質(zhì)粒配比相同的情況下，LipoD293包裝的慢病毒液的具有較強的感染力。

圖B

三、討論

慢病毒體系之所以作為生物介導(dǎo)的方式之一，主要是因為其載體可以將外源基因有效的整合到宿主細(xì)胞中，在具有更高轉(zhuǎn)染效率的同時，避免宿主細(xì)胞對外源基因的切割修飾[3]，從而達(dá)到持久穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒，為真核細(xì)胞的修飾提供了一種有效的手段，在被廣泛研究和優(yōu)化的同時，也被用于科研和臨床基因治療應(yīng)用的學(xué)術(shù)實驗室[4]。然而在慢病毒的包裝過程中，無論選擇三質(zhì)粒系統(tǒng)還是四質(zhì)粒系統(tǒng)，都需要將幾個質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，因此選擇高效、經(jīng)濟、安全的轉(zhuǎn)染試劑和方法以獲得高的轉(zhuǎn)染效率尤其重要。

脂質(zhì)體表面帶正電荷，主要由親水性頭部、鏈接鍵和疏水性尾部三部分構(gòu)成。作為一種高效的轉(zhuǎn)染試劑，首先通過靜電作用與核酸的磷酸根將DNA分子包裹在內(nèi)形成DNA-脂復(fù)合物，再被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞吸附，通過內(nèi)吞、膜的融合等方式將復(fù)合物傳遞入細(xì)胞[5]，是目前實驗室最常用的轉(zhuǎn)染試劑之一。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率、生物毒性主要取決于其結(jié)構(gòu)及表面的修飾[6]。本實驗選取LipoD293是脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)染試劑之一，特有的脂質(zhì)體共軛結(jié)合技術(shù)，目前常用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、單DNA和多DNA片段的共轉(zhuǎn)染。PEI是一種人工合成的多聚陽離子，將DNA壓縮成50-200nm大小的納米球[7]并與其形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過無明顯障礙的粘附內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[8]，實現(xiàn)攜帶質(zhì)粒的表達(dá)。從工業(yè)的原材料到轉(zhuǎn)染試劑，PEI因其價格優(yōu)勢、使用方法簡單、轉(zhuǎn)染效率較高越來越多的被應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)中。但由于PEI的內(nèi)吞可在細(xì)胞膜上形成團(tuán)片狀物，研究表明其細(xì)胞毒性受濃度影響，大于7ug/ml加入細(xì)胞中即可引起細(xì)胞明顯死亡[9]。本實驗選取7ug/ml濃度用作GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞作用時間為4h，并于4h、24h及48h觀察293T細(xì)胞狀態(tài)，并未見明顯細(xì)胞毒性作用。由此可見，除了PEI濃度，質(zhì)粒大小、轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞作用時間、被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的狀態(tài)也是影響其毒性的重要作用。周鵬[10]等人也證實了PEI-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞作用時間在4h轉(zhuǎn)染效率較6h高。

本實驗采用病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)，在質(zhì)粒配比相同的情況下，用PEI和LipoD293包裝的慢病毒液，對比觀察包裝及病毒液感染后293T細(xì)胞中熒光蛋白表達(dá)強弱，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染和病毒感染48h后，LipoD293組293T細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)均高于PEI組，證實在其他條件相同情況下，LipoD293包裝慢病毒效果優(yōu)于PEI，可作為一種高效、經(jīng)濟的轉(zhuǎn)染試劑用于慢病液的制備。