孫成光

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 重慶 400010)

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種DNA病毒，可在人群中通過(guò)血液或者其他體液傳播，引起急性或慢性肝臟損傷。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有2.57億人患有慢性乙肝感染[1]。我國(guó)是乙型肝炎病毒感染大國(guó)，2013年至2017年，我國(guó)普通人群HBV感染患病率為6.89%（95%Cl:5.84%-7.95%），據(jù)此推斷，2018年我國(guó)約有8400萬(wàn)人乙型肝炎病毒表面抗體（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽(yáng)性[2]。

HBV主要傳播途徑有母嬰傳播、密切生活接觸傳播、性傳播等。當(dāng)皮膚黏膜受損時(shí)，接觸到HBV攜帶者的血液、唾液、精液、陰道分泌物等就會(huì)造成病毒的傳播感染[3][4]。近年，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，我國(guó)每年人類(lèi)輔助生殖技術(shù)類(lèi)別總周期數(shù)超100萬(wàn)，出生嬰兒數(shù)超過(guò)30萬(wàn)3，而我國(guó)HBV高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)育齡期男性HBV感染率為6.35-6.47%4，HBV感染對(duì)輔助生殖技術(shù)的影響近些年也受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，男性感染HBV會(huì)導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，引起男性不育[5][6][7]。同時(shí)，HBV的DNA會(huì)整合到胚胎基因組中進(jìn)行表達(dá)，造成胚胎攜帶有HBV，對(duì)胚胎的發(fā)育造成潛在的影響[8][9][10]。然而，對(duì)于男性感染HBV對(duì)冷凍胚胎移植（Frozen embryo transfer，F(xiàn)ET）結(jié)局的影響國(guó)內(nèi)外研究較少。

在IVF-ET過(guò)程中因各種原因無(wú)法移植新鮮胚胎而需將胚胎進(jìn)行冷凍保存，隨后擇期行FET。目前，冷凍胚胎主要使用玻璃化冷凍技術(shù)，胚胎的冷凍、解凍的效率和安全性得到了有效保障。HBV整合到胚胎基因組后會(huì)持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生新的蛋白，這些蛋白可能對(duì)胚胎著床、發(fā)育等造成潛在影響。本文回顧分析男性感染HBV患者FET周期的臨床結(jié)局及其相關(guān)影響。

一、對(duì)象與方法

（一）研究對(duì)象

在2016年1月至2020年3月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖中心行第一次FET輔助生殖助孕患者中進(jìn)行篩選。其中男方血清HBsAg陽(yáng)性，且女方血清HBsAg陰性為HBV感染組，男女雙方血清HBsAg均為陰性的為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)為：移植第3天胚胎細(xì)胞數(shù)小于7或胚胎級(jí)別為三級(jí)；移植囊胚級(jí)別為3BB或4BC以下；女方存在反復(fù)著床失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、控制不良的內(nèi)分泌疾病、宮腔疾病、子宮內(nèi)膜異位癥；男女雙方存在丙型肝炎（HCV）、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染等。

（二）治療方案

1.胚胎冷凍與解凍

在IVF-ET周期中，培養(yǎng)至卵裂期胚胎或囊胚期胚胎，若沒(méi)有移植，可考慮將可利用胚胎進(jìn)行冷凍保存。根據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)[11]卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎定義為：細(xì)胞數(shù)為7-12個(gè)，細(xì)胞大小與發(fā)育階段相符，無(wú)多核現(xiàn)象，碎片率＜10%。囊胚的優(yōu)質(zhì)胚胎定義為：囊胚發(fā)育階段至少為3-4期；內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)規(guī)則，直徑60μm以上，細(xì)胞大小均勻，融合；滋養(yǎng)細(xì)胞層沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球數(shù)明顯超過(guò)10個(gè)，大小均勻，在囊胚底面的細(xì)胞全部形態(tài)清晰，大多數(shù)可見(jiàn)細(xì)胞核。胚胎玻璃化冷凍載體（CRYO BIO SYSTEM-TMV Technologies公司，法國(guó)）和玻璃化冷凍試劑（Vitrification Kit，SAGE公司，美國(guó)）進(jìn)行玻璃化冷凍保存。FET周期的胚胎解凍采用解凍試劑盒（Wanning Kit，SAGE公司，美國(guó)）進(jìn)行胚胎解凍。

2.FET

FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案分為自然周期和人工周期兩種。對(duì)于月經(jīng)規(guī)律，既往內(nèi)膜情況良好的患者可采用自然周期行FET，自然周期于排卵日當(dāng)日開(kāi)始口服孕酮（地屈孕酮，abbott公司，荷蘭）轉(zhuǎn)換內(nèi)膜。對(duì)于既往月經(jīng)不規(guī)律或內(nèi)膜情況較差以及有內(nèi)膜異位、子宮肌瘤等患者，可考慮行人工周期行FET，人工周期一般采用雌孕激素序貫方式建立，轉(zhuǎn)換內(nèi)膜時(shí)間和方式與自然周期相同。卵裂期胚胎一般在內(nèi)膜轉(zhuǎn)換的第4天移植，囊胚則一般在內(nèi)膜轉(zhuǎn)換的第5天移植。每個(gè)FET周期最多移植2枚胚胎。

（三）隨訪觀察指標(biāo)

以臨床妊娠情況作為主要觀察指標(biāo)，以胚胎移植后28-35天，彩超下可見(jiàn)宮內(nèi)孕囊、胎心、胚芽為準(zhǔn)，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)*100%。次要指標(biāo)為胚胎著床率、生化妊娠率和早期流產(chǎn)率。血清人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）≥25IU/L為生化妊娠，生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)*100%。妊娠小于13周流產(chǎn)稱(chēng)為早期流產(chǎn)，早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)*100%。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。定量資料首先采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布組間比較采用t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布則組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。定性資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。單因素Logistic回歸分析妊娠相關(guān)因素，多因素Logistic回歸分析各因素相關(guān)性。所有檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）HBV感染組與對(duì)照組基線資料對(duì)比

感染組與對(duì)照組共計(jì)納入個(gè)770個(gè)FET周期，其中HBV感染組108個(gè)周期，對(duì)照組662個(gè)周期。兩組患者在年齡（女方）、BIM（女方）、繼發(fā)不孕比例、不孕原因、IVF周期獲卵數(shù)、全胚冷凍比例、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備情況、胚胎解凍存活情況、移植胚胎情況等數(shù)據(jù)對(duì)比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象的基線特征

注：*采用Fisher確切概率法

（二）FET周期結(jié)局

兩組患者在臨床妊娠率、胚胎種植率等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在活產(chǎn)率及早期流產(chǎn)率方面兩組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）詳見(jiàn)表2。

表2 FET妊娠情況

（三）單因素Logistic回歸分析

將所有可能對(duì)妊娠結(jié)局造成影響的參數(shù)進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)各因素與臨床妊娠結(jié)局Logistic轉(zhuǎn)換存在線性關(guān)系，詳見(jiàn)表3。從中選擇HBV感染、女方年齡、繼發(fā)不孕、卵巢因素、移植優(yōu)質(zhì)胚胎等因素進(jìn)行多元Logistic回歸分析，詳見(jiàn)表4。

表4 多元Logistic回歸分析結(jié)果

表3 單因素Logistic回歸分析

三、討論

本文通過(guò)回顧性分析FET周期中男性HBsAg攜帶的患者與健康對(duì)照組之間的臨床數(shù)據(jù)對(duì)比分析，探討男性HBsAg攜帶對(duì)FET周期妊娠結(jié)局的影響。研究結(jié)果顯示，男性HBV感染對(duì)于胚胎的解凍存活、胚胎種植、臨床妊娠率等無(wú)影響，但HBV組在活產(chǎn)率（28.7%vs41.1% P=0.015）和早期流產(chǎn)率（27.9%vs13.1%P=0.010）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HBV感染會(huì)增加早期妊娠的流產(chǎn)率，降低活產(chǎn)率。多元Logistic回歸結(jié)果顯示女方年齡（OR=0.932，95%CI=0.891-0.980，P=0.005）和移植優(yōu)質(zhì)胚胎（OR=0.671，95%CI=0.457-0.985，P=0.042）對(duì)臨床妊娠結(jié)局有較大影響，而HBV感染對(duì)于臨床妊娠率無(wú)明顯影響。

Hu等[12]對(duì)女方、男方或男女雙方均為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清反應(yīng)陽(yáng)性的夫婦的卵母細(xì)胞及胚胎進(jìn)行通過(guò)熒光原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞及胚胎細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)HBVDNA。同時(shí)Ye[13]等在女方HBV攜帶的胚胎中檢測(cè)出HBV mRNA,顯示HBV存在轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及產(chǎn)生蛋白質(zhì)等，這些都可能對(duì)胚胎造成影響。葉峰等[14]通過(guò)對(duì)慢性HBV感染父親體外受精后遺棄胚胎進(jìn)行單細(xì)胞RT-PCR發(fā)現(xiàn)胚胎中檢測(cè)出HBVmRNA。同時(shí)其研究顯示，父親攜帶有HBV感染的胚胎移植后臨床妊娠率無(wú)明顯差異，檢測(cè)出有HBVmRNA攜帶的1例同期移植的新鮮胚胎發(fā)生了早期流產(chǎn)。本研究顯示，男方有HBV感染FET周期胚胎在解凍移植后胚胎種植率（32.7%vs34.2% P=0.701）、臨床妊娠率（39.8%vs48.5% P=0.094）無(wú)明顯差異，但早期流產(chǎn)率（27.9%vs13.1% P=0.010）升高明顯，活產(chǎn)率明顯下降（28.7%vs41.1% P=0.015）。

目前大量研究顯示女性感染HBV會(huì)輔助生殖結(jié)局造成影響，如對(duì)于男性HBV感染對(duì)FET周期臨床結(jié)局影響的報(bào)道非常少，He F等[15]2018年首次報(bào)道了FET周期中男性感染HBV對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響。該文章納入HBV感染周期39個(gè)，陰性周期78個(gè)，其結(jié)果顯示HBV感染會(huì)降低臨床妊娠率、胚胎種植率及活產(chǎn)率，本研究結(jié)果與其具有一致性。但其流產(chǎn)率兩組比較無(wú)明顯差異與本研究相左。分析原因如下：均系回歸性研究，樣本納入存在一定偏倚；男性感染HBV導(dǎo)致胚胎攜帶有HBV的感染效率不是很明確；本次研究是在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行的數(shù)據(jù)收集可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果差異；需要更多的前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究系回顧性研究，相對(duì)存在一些缺陷：樣本納入以本單位收治的病人為來(lái)源，缺乏多中心樣本；缺乏對(duì)FET胚胎的HBVDNA檢測(cè)數(shù)據(jù)，后續(xù)可考慮從FET培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)；在樣本量擴(kuò)大的前提下可制定更加嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)，如增加卵巢功能評(píng)估、促排卵方案的評(píng)估、不良生活習(xí)慣及心理狀態(tài)評(píng)估等；后續(xù)研究可考慮進(jìn)行前瞻性研究，進(jìn)一步評(píng)價(jià)男性HBsAg攜帶對(duì)胚胎冷凍及胚胎發(fā)育的影響。